Оптимизация процесса экстракции астаксантина с помощью ультразвука

 Астаксантин - это каротиноид с сильной антиоксидантной активностью, который широко используется в медицине, функциональном питании и косметике. В последние годы мировой рынок астаксантина быстро растет и, как ожидается, к 2030 году достигнет 3,4 миллиарда долларов США. Красная водоросль - это вид одноклеточных зеленых водорослей, способных синтезировать большое количество астаксантина в условиях стрессовой культуры, содержание которого может достигать 5% от сухого веса клетки, что является одним из лучших источников натурального астаксантина. Из-за плотной клеточной стенки Rhodococcus aureus при извлечении астаксантина необходимо ее разрушить. Физические методы, такие как гомогенизация под высоким давлением и разрушение стенок с помощью ультразвука, являются наиболее предпочтительными из-за их преимуществ - меньшего повреждения активных ингредиентов и низкой стоимости[4] .

 

В настоящее время для извлечения астаксантина обычно используются органические растворители, такие как метиленхлорид, ацетон и этилацетат. Однако эти органические растворители обладают определенной токсичностью и риском для безопасности. Использование нетоксичных "зеленых" растворителей для замены токсичных растворителей, снижения загрязнения процесса экстракции и повышения безопасности продукта стало ключевым вопросом в экстракции астаксантина. Zou et al[5] использовали смесь этилацетата и этанола в качестве растворителя для извлечения астаксантина из Rhodococcus pyrenoidus, и самый высокий выход астаксантина был достигнут при содержании этанола 50%. В последние годы для экстракции астаксантина стали использовать новые растворители, такие как сверхкритический CO2 [5], не содержащий остатков растворителя, и ионные жидкости, обладающие низкими точками плавления и высокой растворяющей способностью, и был достигнут определенный прогресс. Однако вышеперечисленные методы экстракции основаны на использовании водорослевого порошка в качестве сырья, процесс сушки водорослевого порошка требует большого количества энергии, что значительно увеличивает стоимость астаксантина.

В данном исследовании в качестве экстракционного растворителя использовался экологически чистый и нетоксичный этанол, а для извлечения астаксантина из свежих красных водорослей применялся метод ультразвукового воздействия. Было исследовано влияние различного времени экстракции, соотношения материала и жидкости и мощности ультразвука на скорость экстракции астаксантина. Для оптимизации оптимальных параметров процесса и изучения кинетических процессов при оптимальном процессе экстракции был использован метод поверхности отклика.

1 Опыт

1.1 Материалы и инструменты

Свежие водоросли Rhodococcus pyrenoidus, предоставленные Ключевой лабораторией по подготовке и функциональному развитию активных веществ водорослей в провинции Фуцзянь; стандарт астаксантина (ВЭЖХ≥98%), Shanghai Yuanye Biotechnology Co.

Высокоэффективный жидкостный хроматограф (ВЭЖХ) 2695, 2489, Waters Corporation; высокоскоростная центрифуга H1650-W, Hunan Xiangyi Experimental Instrument Development Co.

 

1. 2 Методика проведения эксперимента

1. 2. 1 Метод извлечения

В ходе эксперимента 1,00 г свежих водорослей взвешивали и смешивали с безводным этанолом в разных пропорциях, а затем помещали в ультразвуковое оборудование для вспомогательной экстракции. Время экстракции, мощность ультразвука и соотношение материала и жидкости варьировались для изучения влияния вышеперечисленных факторов на скорость экстракции астаксантина.

 

1. 2. 2 Односторонние эксперименты

(1) Время извлечения

Скорость экстракции астаксантина анализировали, фиксируя соотношение материала и жидкости 1∶ 10, мощность ультразвука 65,4 Вт и изменяя время экстракции (10 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин).

(2) Ультразвуковая мощность

Оптимальное время экстракции выбирали, фиксируя соотношение материала и жидкости на уровне 1∶ 10, и варьировали мощность ультразвука (65,4 Вт, 168 Вт, 276 Вт) для анализа степени извлечения астаксантина.

(3) Соотношение материала и жидкости

Были выбраны оптимальное время и мощность ультразвука, соотношение корма и жидкости варьировалось (2,5%, 5%, 10%, 20%) для анализа степени извлечения астаксантина, и каждый эксперимент повторялся три раза.

 

1. 2.3 Экспериментальный дизайн поверхности отклика

Таблица 1 Независимые параметры и их кодированные уровни

 

независимый фактор	уровень (достижений и т.д.)
	-1	0	1
1 Время экстракции (X )/мин	20	40	60
2 Мощность ультразвука r(X )/W	20	60	100
3 Соотношение материала и жидкости (X )/ (г/мл)	2. 5	5	7. 5

 

Исследовались три фактора: время экстракции (X1), мощность ультразвука (X2) и соотношение материала и жидкости (X3), а данные анализировались с помощью программы статистического анализа SAS9.0 с выходом астаксантина (Y) в качестве ответной величины. Уровни трех факторов были выбраны, как показано в таблице 1.

 

1.3 Анализ астаксантина

Содержание астаксантина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по методике, описанной Liu et al.

 

1.4 Кинетика экстракции астаксантина

Экстракция астаксантина проводилась при указанных выше оптимальных условиях, а концентрация астаксантина в экстракте измерялась через регулярные промежутки времени до достижения равновесия. Для моделирования процесса экстракции астаксантина использовались первичная и вторичная кинетические модели.

 

1.5 Анализ антиоксидантной активности

Способность к поглощению 1,1-дифенил-2-тринитрофенилгидразинового радикала (1,1-дифенил-2-тринитрофенилгидразиновый радикал, DPPH) и гидроксильного радикала (- OH) определяли по методу Liu, Lulu et al [9].

 

2 Результаты и обсуждение

2.1 Оптимизация условий экстракции

2. 1. 1 Односторонняя оптимизация условий экстракции

Результаты однофакторной оптимизации представлены на рис. 1. Видно, что выход астаксантина увеличивается с увеличением времени экстракции, достигая 19,87 мг/г DCW при 40 мин. При последующем увеличении времени экстракции увеличение выхода астаксантина было неочевидным. Напротив, выход астаксантина постепенно снижался с увеличением мощности ультразвука. В основном это связано с эффектом "пещеры" ультразвука, который влияет на стабильность астаксантина, и чем выше мощность ультразвука, тем больше вероятность того, что астаксантин будет разрушаться. При увеличении соотношения материала и жидкости с 1:40 до 1:5 количество экстрагированного астаксантина увеличивалось, а затем уменьшалось, достигнув максимума 32,7 мг/г при соотношении материала и жидкости 1:20. Это связано с равновесием растворимости астаксантина: при высоком соотношении материал-жидкость концентрация астаксантина в жидкой фазе (этанол) была выше и быстро приближалась к точке равновесия, что приводило к низкой движущей силе массопереноса, тем самым влияя на перенос астаксантина из твердой фазы (микроводоросли) в жидкую[10] . Поэтому для последующих экспериментов было выбрано время экстракции 40 мин, мощность ультразвука 65,4 Вт и соотношение материала и жидкости 1:20.

 

2. 1. 2 Методология поверхности отклика для оптимизации условий экстракции

Для дальнейшей оптимизации условий экстракции использовалась методология поверхности отклика, а в качестве значения отклика использовалось значение выхода астаксантина (Y), схема эксперимента и результаты представлены в таблице 2. Данные в таблице 2 были подогнаны под регрессионную модель поверхности отклика, и были получены следующие уравнения регрессии с временем ультразвука (X1), мощностью ультразвука (X2) и соотношением материала и жидкости (X3) в качестве независимых переменных.

y = 1 217. 189 + 123. 730 1x1 + 254. 904 3x2 - 172. 552 5x3 +

1. 967 742x-186. 705 9x1x2 -3. 39x1x3 -267. 938 6x+34. 055 03x2x3 -.

193. 047 3X3 2

Таблица 2 Экспериментальная схема Бокса-Бенкена и результаты

 

Запускайте	X1	X2	X3	Выход астаксантина/ (мг/г)
1	-1	-1	0	15. 66
2	-1	1	0	35. 88
3	1	-1	0	31. 44
4	1	1	0	35. 83
5	0	-1	-1	26. 99
6	0	-1	1	20. 81
7	0	1	-1	31. 80
8	0	1	1	29. 19
9	-1	0	-1	34. 52
10	1	0	-1	36. 38
11	-1	0	1	27. 12
12	1	0	1	29. 22
13	0	0	0	35. 16
14	0	0	0	35. 42
15	0	0	0	34. 07

 

Таблица 3 Дисперсионный анализ (ANOVA) для ответов

поверхностная методология

 

	(количество) степеней свободы (физика)	средний квадрат	F-значение	P-value	значение
моделирование	9	140 466 1	6. 896 148	0. 023 4	*
X1	1	122 473	5. 411 502	0. 067 5
X2	1	519 809. 4	22. 967 91	0. 004 9	*
X3	1	238 194. 9	10. 524 7	0. 022 8	*
X1 2	1	14. 296 64	0. 000 632	0. 980 9

 

По результатам анализа поверхности отклика ANOVA (табл. 3), регрессионная модель была хорошо подогнана (коэффициент детерминации R2 = 0. 925 4) и значима (P<0. 05), что может быть использовано для теоретического прогнозирования оптимизации экстракции астаксантина. Как показано в табл. 3, мощность ультразвука (X2 ) была наиболее значимым фактором в первичном члене (P = 0. 004 9), за которым следовало соотношение жидкость-жидкость (X3 ) (P < 0. 022 8); мощность ультразвука (X2 2 ) была наиболее значимым фактором во вторичном члене (P < 0. 018 8); и время ультразвука и мощность ультразвука (X1 X2 ) были наиболее значимыми факторами в кросс-корреляционном члене (P = 0. 055). Наиболее значимое влияние пересечения оказали время ультразвука и мощность ультразвука (X1 X2 ) (P = 0. 055). Поверхности отклика и их контурные графики на рис. 2 также показывают, что контуры X1 и X3, а также X2 и X3 имеют эллиптическую форму, что указывает на относительно большое взаимодействие между ними.

 

Теоретический выход астаксантина был рассчитан как 36,02 мг/г DCW по приведенному выше уравнению регрессионной модели, а условия экстракции включали время ультразвукового воздействия 28 мин, мощность ультразвука 87 Вт и соотношение материала и жидкости 1:25. Чтобы проверить точность предсказаний модели, оптимальные условия, полученные в результате подгонки, были использованы для экспериментов по экстракции, и фактический выход астаксантина составил (35. 93±0. 37) мг/г DCW. Экспериментальное значение выхода астаксантина совпало с предсказанным значением с погрешностью 0,25%, что говорит о том, что экспериментальное значение хорошо согласуется с предсказанным значением модели, и модель может быть использована.

 

2.2 Кинетика экстракции астаксантина

В данном исследовании кинетическая модель первого порядка и кинетическая модель второго порядка были использованы для подбора параметров при оптимальных условиях экстракции с целью изучения влияния концентрации на скорость экстракции. Как показано на рис. 3, R2 кинетической модели второго порядка = 0,998 7, что указывает на то, что она может хорошо описывать процесс экстракции астаксантина. Напротив, R2 для кинетической модели первого порядка составил всего 0,882 0. Амадо и др[11] обнаружили, что экстракция астаксантина из отходов креветок также соответствует кинетическому закону второго порядка. Это говорит о том, что кинетика массопереноса (т.е. Ce-Ct) является ключевым фактором, влияющим на эффективность экстракции астаксантина, и ее влияние на скорость массопереноса (т.е. скорость экстракции) гораздо больше, чем влияние кинетики первого порядка. Поэтому для дальнейшего увеличения выхода астаксантина можно рассмотреть возможность использования многократной экстракции в течение короткого времени, чтобы обеспечить высокую кинетику массопереноса.

 

2.3 Анализ антиоксидантной активности экстрактов астаксантина

В настоящем исследовании также оценивалась антиоксидантная активность экстракта астаксантина, приготовленного по оптимизированной технологии. Результаты показали, что полуингибирующие концентрации (IC50) экстракта астаксантина против радикалов DPPH и OH составили (16,14 ± 1,58) мкг/мл и (0,93 ± 0,18) мкг/мл, соответственно (рис. 4). По сравнению со способностью астаксантина, экстрагированного ДМСО по методу Yin et al. [12], к поглощению радикалов DPPH и OH (с IC50 30 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно), полуингибирующая концентрация экстрактов астаксантина, приготовленных настоящим методом, была ниже, а антиоксидантная активность экстрактов астаксантина была выше.

 

3 ВЫВОДЫ

В данном исследовании этанол использовался в качестве экстракционного растворителя для извлечения астаксантина из свежих красных водорослей методом ультразвукового воздействия, а параметры экстракции были оптимизированы с помощью односторонних экспериментов и дизайна поверхности отклика для получения оптимальных условий экстракции: время ультразвука 28 мин, соотношение материал-жидкость 1:25 и мощность ультразвука 87 Вт, что привело к выходу астаксантина (35. 93±0. 37) мг/г DCW. Влияние каждого фактора на содержание астаксантина в экстракте было следующим: мощность ультразвука, соотношение материала и жидкости > время ультразвука. При этом кинетика экстракции астаксантина в оптимальных условиях соответствовала характеристикам вторичной кинетики, т.е. скорость экстракции была пропорциональна квадрату разности концентраций раствора. Экстракт астаксантина, полученный данным методом, обладает хорошей антиоксидантной активностью, его полуингибирующие концентрации DPPH и OH составили (16,14 ± 1,58) мкг/мл и (0,93 ± 0,18) мкг/мл, соответственно.

 

Ссылки.

[1] Li X , Wang X Q , Duan C L , et al. Биотехнологическое производство астаксантина из микроводоросли Haematococcus pluvialis [ J ] .  Biotechnol. adv., 2020, 43 : 107 602.

[2] Ahirwar A , Meignen G , Khan M J , et al. Свет модулирует транскриптомную динамику, регулируя накопление астаксантина в Haematococcus: A review [ J] . .   Bioresour. technol., 2021, 340: 125 707.

[3] Khoo K S , Lee S Y , Ooi C W , et al. Recent advances in biorefinery of astaxanthin from Haematococcus pluvialis[ J] .   Bioresour. technol., 2019, 288 : 121 606.

[4] Lee S Y , Cho J M , Chang Y K , et al. Cell disruption and lipid extraction for microalgal biorefineries : a review [ J ] .     Bioresoure Technology, 2017, 244(2) : 1 317-1 328.

[5] Cheng X, Qi Z B, Burdyny T, et al. Низкое давление сверхкритического CO2, экстракция астаксантина из Haematococcus pluvialis продемонстрирована на микрофлюидном чипе[J] .  Bioresoure Technology, 2018, 250 : 481-485.

[6] Gao Hong , Zhang Wei , Gan Wenmei , et al.  Синергетическая микроструйная экстракция астаксантина сверхвысокого давления и его антиоксидантные свойства с помощью ионных жидкостей[J] .  Современная химическая промышленность, 2022, 42(6): 171-177.

[7] Khoo K S , Ooi C W , Chew K W , et al. Пермеабилизация Haematococcus pluvialis и твердо-жидкостная экстракция астаксантина с помощью CO2 -базированных алкил карбаматных ионных жидкостей на основе CO2[J] .  Chem. Eng. J., 2021, 411: 128 510.

[8] Liu L , Liu X , Jia J , et al. Экономический анализ летучих характеристик Haematococcus pluvialis и влияние температуры обжаривания на профиль летучих веществ и химических компонентов [ J] .   Algal Research, 2022, 64: 102 690.

[9] Liu Lulu , Chen Minxuan , Liu Xiaohui , et al.  Влияние Erythrocystis rainbowii на качество шифонового пирога и стабильность астаксантина в нем[J] .  Наука и технология пищевой промышленности, 2022, 43(19) :76-83.

[10] Zou T B , Jia Q , Li H W , et al. Response surface methodology for ultrasound - assisted extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis [J] .  Marine Drugs, 2013, 11(5): 1 644-1 655.

[11] Amado I R , Vazquez J A , Murado M A , et al. Извлечение астаксантина из сточных вод при варке креветок: оптимизация экстракции астаксантина с помощью методологии поверхности отклика и кинетических исследований [J] . поверхностной методологии и кинетических исследований [ J] .    Food and Bioprocess Technology, 2014, 8(2) : 371-381.

[12] Yin Q , Shang X Y , Zhang Z S , et al. Исследование свойств астаксантина по уничтожению свободных радикалов[J] .  Пищевая наука и технология, 2010, 4: 239-241.