Исследования по производству астаксантина с использованием дождевых красных водорослей

 Астаксантин - ценное биологически активное вещество, вошедшее в сферу прикладных исследований и разработок только в последние годы. Он обладает мощной антиоксидантной активностью, в 10 раз превышающей активность других каротиноидов и в 550 раз - витамина Е, и получил название "супервитамина Е" [1, 2]. Астаксантин выполняет целый ряд физиологических функций, таких как укрепление иммунитета, борьба с раком, предотвращение старения кожи, поддержание здоровья глаз и центральной нервной системы [3, 4].

В настоящее время астаксантин широко используется в аквакультуре и оказывает значительное влияние на усиление окраски объектов аквакультуры, повышение выживаемости, а также способствует росту, воспроизводству и развитию [5-7]. Он был одобрен в качестве безопасного корма для животных в Европе, Америке и Японии. Кроме того, в здравоохранении, косметике и медицине мощная физиологическая эффективность астаксантина и его широкие рыночные перспективы также привлекли широкое внимание на международной арене. В настоящее время коммерческое производство астаксантина успешно налажено в зарубежных странах, его рыночная цена составляет около 2500 долларов США за кг, а спрос на него стремительно растет [8].

В мире существует два типа производства астаксантина: химический синтез и биологическая экстракция. Однако химически синтезированный астаксантин уступает натуральному астаксантину по структуре, функциям, применению и безопасности. В настоящее время страны мира к химическому синтезу астаксантина относятся все более строго, например, Управление по контролю за продуктами и лекарствами США запретило его поступление на рынок здорового питания. Результаты экспериментов на животных и людях показывают, что натуральный астаксантин не обладает никакими патогенными эффектами или токсическими побочными эффектами и абсолютно безопасен для человека [4]. Поэтому разработка природного астаксантина и его биологических источников стала важным вопросом в исследованиях по производству астаксантина.

В настоящее время среди природных источников астаксантина самое высокое содержание астаксантина наблюдается в красной водоросли Haematococcus plu℃ialis, а структурная форма астаксантина соответствует требованиям, предъявляемым к объектам аквакультуры, поэтому она признана лучшим биологическим источником производства астаксантина в естественном мире［8,9］, и в последние годы она стала горячей точкой исследований астаксантина в стране и за рубежом. Тем не менее, технология производства астаксантина из R. rainbowii все еще нуждается в улучшении, особенно в культуре R. rainbowii, накоплении и извлечении астаксантина, все еще существуют значительные технические трудности. Поэтому в данной статье в основном представлены результаты международных исследований по вышеуказанным вопросам за последние годы с целью содействия коммерциализации производства астаксантина в Китае.

1 Биологические свойства Rhodococcus pyrenoidus

1.1 Общая характеристика Rhodococcus pyrenoidus

Rhodococcus rainieri - микроскопическая одноклеточная зеленая водоросль с особыми биологическими свойствами и разнообразной жизненной историей, имеющая четыре формы: подвижные клетки, подвижные споры, неподвижные клетки и неподвижные споры. В условиях низкой освещенности, богатой азотом и фосфором среды она существует в основном в виде зеленых подвижных клеток, во время которых рост R. rainbowensis происходит энергично, а клетки содержат небольшое количество астаксантина; в неблагоприятных для выживания условиях (высокая освещенность, высокая температура, высокая соль и питательное голодание) она существует в виде неподвижных спор (толстостенные споры), и в это время клетки водоросли часто имеют красный цвет из-за наличия большого количества астаксантина［10］.

Традиционно считается, что накопление астаксантина происходит в основном на стадии толстостенной споры [10-12]. Однако последние исследования показали, что накопление астаксантина у R. rainbowii не зависит от прекращения деления клеток, образования толстостенных спор и потери подвижности клеток, а что накопление астаксантина может происходить в течение трофического периода водоросли, и что ее свободноживущие клетки могут синтезировать большое количество астаксантина с той же скоростью, что и толстостенные споры [13, 14].

1.2 Механизмы накопления астаксантина

В стране и за рубежом было проведено большое количество исследований механизма накопления астаксантина в R. rainbowii, и полученные выводы противоречивы [11, 15-19].  Существуют две основные точки зрения: одна заключается в том, что накопление астаксантина под сильным светом в основном играет роль световой фильтрации, защищая активно растущие клетки Rhodococcus rainbowensis и его фотосинтез от повреждения сильным светом [17]; другая - что накопление астаксантина является вторичным метаболитом неподвижных клеток, который ограничивается возникновением неблагоприятных условий [18]. Tjahjono et al. (1994) показали, что индуцированное светом образование реактивного кислорода способствует синтезу астаксантина и устойчивости к окислительному повреждению, вызванному неблагоприятными условиями [19].

2 Культивирование Rhodococcus rainieri и получение астаксантина

В настоящее время, в зависимости от различных форм красных водорослей, производство астаксантина делится на два этапа: культивирование микроводорослей и накопление астаксантина. На первом этапе основной целью является культивирование красных водорослей для обеспечения их высокой плотности роста. На этом этапе возможны два способа производства, так называемые периодические и полунепрерывные культуры. Порционные культуры - это микроводоросли, выращенные в стабильном культуральном растворе. Полунепрерывные культуры - это культуры, в которых каждый день после достижения значительной концентрации клеток водорослей часть культурального бульона удаляется и переносится в стрессовую среду, а культура продолжается с равным количеством нового бульона, таким образом, R. rainieri может производиться непрерывно в условиях, поддерживающих постоянную скорость роста и стабильные физиологические характеристики. На втором этапе проводится серия стрессов, таких как высокая освещенность, высокая температура, высокая соль и питательное голодание, чтобы вызвать трансформацию R. rainbowii в толстостенные споры в суровых условиях выживания для достижения цели накопления астаксантина [20, 21]. На этих двух этапах питательные и экологические условия, необходимые микроводорослям, различны, и современные отечественные и международные исследования в основном сосредоточены на выборе и контроле условий на этих двух этапах.

2.1 Изучение влияния факторов окружающей среды

Питательные и физические факторы среды, влияющие на культуру Rhodococcus aureus, в основном включают температуру, интенсивность света, pH, растворенный кислород, питательные соли и т.д., о которых сообщалось во многих отечественных и зарубежных исследованиях [21-38]. Диапазоны значений основных факторов, влияющих на две стадии производства астаксантина, приведенные в литературе, обобщены в таблице 1.

Табл. 1. Сумма условий двухстадийных культур для получения астаксантина из

Haematococcus plu℃ialis

 

сцена	Интенсивность света (клк)	Температура (°C)	Значение PH	Пищевая соль
				3N (ммоль "дм )	3P (ммоль "дм )	3C (ммоль "дм )
Стадия культивирования клеток с питательными веществами Стадия накопления астаксантина	1. 1~2. 0 10~36. 6	20~25 30~35	7~8 7	2. 5~10 0. 30	0. 57 -	15~30 0. 04

 

 

2. 1. 1 Свет

Принято считать, что для культивирования трофических клеток Rhodococcus rainbowensis благоприятен низкий уровень освещенности - менее 2 клк. Высокая интенсивность света может способствовать быстрому накоплению астаксантина, однако слишком высокая интенсивность света может привести к массовой гибели красных водорослей [18, 20, 28, 29].

 

2. 1. 2 Температура  

Для роста Rhodococcus rainieri подходит низкотемпературная среда. По имеющимся данным, температура варьирует в широких пределах, в основном от 14 до 28 °C [22, 27, 29, 30]. Повышение температуры благоприятно для накопления астаксантина [19, 27]. Tjahjono et al. (1994) обнаружили, что накопление астаксантина в Rhodococcus erythropolis при 30℃ было в три раза выше, чем при 20℃ [19]. TriPathi et al. (2002) пришли к выводу, что температура инкубации 35℃ может способствовать накоплению астаксантина при различных питательных условиях [27].

 

2.1.3 Соленость  

Соответствующее повышение солености может способствовать спорообразованию и накоплению астаксантина [20, 32]. Sarada et al. (2002) показали, что концентрация Nacl в культуральном бульоне не должна превышать 1,0%, иначе это приведет к массовой гибели Rhodococcus rainbowensis [21].

 

2. 1. 4 PH  

Обычно считается, что Rhodococcus erythropolis подходит для роста в нейтральных или слабощелочных условиях [25, 33]. Сарада и др. (2002) показали, что максимальное производство клеток достигается при значении pH 7,0, при этом также значительно увеличивается производство астаксантина [21].

 

2.2 Влияние параметров питательной соли

2. 2. 1 Азотные питательные соли  

Азот необходим для роста Rhodococcus pyrenoidus. Исследования показали, что оптимальным источником азота для культуры красных водорослей является нитрат, концентрация которого находится в диапазоне 2,5-10 ммоль "дм3 [22, 31]. Дефицит азота может привести к накоплению астаксантина. Fαbregas et al. (2001) показали, что накопление астаксантина происходило только при полном истощении азота в культуральном растворе [34]. Boussiba et al. (1992) сообщили, что присутствие азота необходимо для накопления астаксантина [28].

 

2. 2. 2 Фосфорные питательные вещества  

Умеренная концентрация фосфора (0,1 г "дм3K2HPO4) достаточна для удовлетворения потребностей роста Rhodococcus pyrenoidus [11]. В других исследованиях было показано, что фосфорное голодание может способствовать накоплению астаксантина, но его влияние не столь значительно, как азотное [17, 20]. Однако Boroeitzka et al. (1991) отметили, что высокий уровень P благоприятствует накоплению астаксантина [31].

 

2. 2. 3 Источники углерода  

Добавление определенной концентрации ацетата в культуральную среду благоприятно сказывается на росте Rhodococcus rainbowensis [12, 30]. Zhuang Huiru et al.

(2000) показали, что ацетат натрия был более пригоден, чем другие источники углерода, для поддержания смешанного трофического и гетеротрофного роста Rhodococcus rainbowensis. Концентрация ацетата натрия, необходимая Rhodococcus rainbowensis, составляла 0,5-1,0 г "дм3 и 1-1,5 г "дм3 для двух типов питательных сред, соответственно [35]. Достаточное количество источников углерода также важно для накопления астаксантина [12, 27, 36]. Однако Orosa et al. (2001) предположили, что рост Rhodococcus erythropolis будет серьезно подавлен, если добавить слишком много углерода [37].

 

2. 2. 4 Витамины  

В настоящее время роль витаминов на рост Rhodococcus rainbowensis остается спорной [34, 38]. Чуань-Инь Джин и др. (1997) предположили, что добавление соответствующих количеств витаминов B1 и B12 может способствовать росту Rhodococcus pyrenoidus [38]. Однако Fαbregas et al. (2001) показали, что добавление витаминов не оказывает существенного влияния на рост красных водорослей [34].

 

2. 2. 5 Реактивный кислород  

Пониженный уровень DO благоприятен для автотрофного роста Rhodococcus rainbowensis, в то время как насыщенный DO более благоприятен для его гетеротрофного роста [13]. Кроме того, присутствие DO и различных реактивных молекул кислорода может эффективно индуцировать внутриклеточный синтез и накопление астаксантина [19, 20, 26, 36].

 

2. 2. 6 Fe2+    

Кобаяси и др. (1991) показали, что высокие концентрации ионов двухвалентного железа способствуют накоплению астаксантина в Rhodococcus pyrenoidus [12]. Этот эффект ингибировался в присутствии KI, а синтез астаксантина благоприятствовался при добавлении Fe2+ вместе с ацетатом [36]. Харкер и др. (1996) показали, что влияние Fe2+ было не столь значительным, как влияние азотных и фосфорных питательных веществ [20].

 

2.3 Исследования на культуральных средах

Как уже упоминалось выше, многие ученые провели большое количество исследований факторов, влияющих на рост микроводорослей и накопление астаксантина, но большинство из них в основном сосредоточены на влиянии какого-то одного фактора [25, 27, 30, 32]. В последние годы изучение полной рецептуры среды постепенно привлекает внимание отечественных и зарубежных ученых, и некоторые ученые начали работать над этим аспектом, пытаясь достичь более эффективного производства астаксантина путем сочетания эффективной рецептуры среды и условий окружающей среды [34, 39].

Gong и Chen (1997, 1998) разработали серию концентраций пяти компонентов культуральной среды (ацетат натрия, нитрат калия, резерв макроэлементов, резерв микроэлементов и витамины) в ограниченной культуре Rhodococcus pyrenoidus, изучили влияние изменения концентрации различных компонентов на рост Rhodococcus pyrenoidus и определили оптимальные концентрации этих пяти компонентов [23, 39]. Chuan-Yin Jin et al. (1996, 1997) сравнили три культуральные среды (MCM, BBM и BG-11), которые широко использовались в зарубежных исследованиях, для роста 748 штаммов Rhodococcus aquaticus, и попытались улучшить рецептуру культуральных сред [38, 40]. Qiu Baosheng et al. (1999) модифицировали рецептуру среды SM для Rhodococcus americanus с целью увеличения буферной емкости культурального раствора, используя фосфатную и глицилглициновую буферную систему, и исследовали влияние этой рецептуры среды на рост Rhodococcus americanus [33].

Fαbregas et al. (2000) исследовали влияние 18 питательных веществ на рост Rhodococcus rainbowensis в полунепрерывной культуре со скоростью обновления 20% и определили соответствующие концентрации [24].

 

3 Прогресс в коммерческом производстве астаксантина из Rhodococcus aureus

В настоящее время крупномасштабное производство натурального астаксантина из Rhodococcus aureus обычно осуществляется в два этапа: на первом этапе Rhodococcus aureus культивируется в больших масштабах в закрытой системе фотобиореакторов для достижения высокой плотности роста водорослевых клеток и преодоления проблем загрязнения; на втором этапе Rhodococcus aureus стимулируется к накоплению астаксантина в условиях стресса [12, 20, 21, 41]. Основной процесс представлен на рисунке 1.

Температура, pH и концентрация питательных солей автоматически регулировались компьютером для оптимизации условий. Для снижения pH и повышения урожайности постоянно вносился CO2, а для охлаждения культуральной системы использовалась низкотемпературная вода. Сначала культивировали Rhodococcus pyrenoidus, а через некоторое время начинали воздействовать на среду или питательные вещества, чтобы стимулировать накопление астаксантина в Rhodococcus pyrenoidus. Толстостенные споры начинали формироваться и накапливать астаксантин в течение 2-3 дней после экологического стресса, и их собирали через 3-5 дней после формирования толстостенных спор. Водорослевую жидкость концентрировали путем отстаивания и центрифугирования. В концентрированную водорослевую суспензию добавляли антиоксиданты для предотвращения окисления астаксантина, затем суспензию высушивали до состояния водорослевого порошка и механически измельчали для разрушения клеток, после чего подвергали серии операций по обработке и хранению продукта [8, 41].

В последние годы технология извлечения натурального астаксантина из красных водорослей достигла большого прогресса за рубежом. В Швеции одна из компаний использует для производства астаксантина полностью закрытый фотобиореактор (с искусственным облучением источника). В США компания Aquasearch Inc. использует управляемый компьютером открытый закрытый фотобиореактор (AGM) объемом 25 000 дм3 для культивирования E. amylovora [41]. Cyanotech, с другой стороны, использует закрытый "платформенный" фотобиореактор для культивирования Rhodococcus rainbowensis [8].

 

4 Проблемы и перспективы

4.1 Основные проблемы нынешнего Wan Ruifang

Несколько иностранных компаний реализовали производство натурального астаксантина из микроводорослей и сформировали монополию на технологию производства, что привело к высокой рыночной цене на натуральный астаксантин. Отечественное производство астаксантина все еще не имеет соответствующих технологий крупномасштабного производства. В нынешней ситуации производство астаксантина из красных водорослей в основном существует в следующих аспектах проблемы:

(1) R. rainieri чувствительна к изменениям окружающей среды, имеет короткий период экспоненциального роста, менее устойчива к бактериальному и простейшему заражению и теряет способность к размножению в экстремальных условиях, поэтому создать стабильную и высокоэффективную технологическую систему производства нелегко. Таким образом, производство астаксантина путем культивирования красных водорослей все еще представляет собой техническую проблему с точки зрения условий культивирования клеток высокой плотности и экологического контроля за накоплением астаксантина.

(2) Накопление астаксантина в толстостенных спорах Rhodococcus pyrenoidus происходит в цитоплазме, а толстостенная структура спор создает ряд неудобств для извлечения и утилизации астаксантина. Чтобы повысить его биодоступность, необходимо разрушить клеточную стенку микроводоросли, а это соответственно повышает требования к процессу производства.

(3) Культивирование Rhodococcus rainieri требует много времени, имеет низкую урожайность и плохую непрерывность, а Rhodococcus rainieri погибают в большом количестве во время стресса, что не способствует масштабному культивированию.

(4) Культивирование Rhodococcus rainieri в больших прудах ограничивает использование световой энергии, что снижает эффективность фазы накопления астаксантина и увеличивает производственные затраты.

 

4.2 Направления развития исследований по получению астаксантина из R. rainbowensis

Для скорейшей коммерциализации производства астаксантина из микроводорослей рекомендуется сосредоточить отечественные исследования Rhodococcus pyrenoidus на следующих аспектах, чтобы решить вышеперечисленные проблемы:

(1) Изучить более простые и эффективные методы культивирования Rhodococcus rainbowensis. Способствовать непрерывному производству клеток водорослей с постоянной скоростью роста в условиях стабильных физиологических характеристик.

(2) Разработка методики культивирования, способствующей накоплению астаксантина в больших количествах в подвижных клетках Rhodococcus pyrenoidus. Это позволит сэкономить время культивирования и извлечь астаксантин, когда клеточная стенка тонкая, что упростит процесс разрушения клеточной стенки. Грюневальд и Хаген (2000) продемонстрировали, что извлечение астаксантина из трофобластов Rhodococcus pyrenoidus вполне осуществимо [42]. Это дает новую идею для упрощения процесса разрушения стенки, но вопрос о том, как способствовать накоплению астаксантина в питательных клетках, требует дальнейшего изучения.

(3) Дальнейшие исследования экологического контроля высокоплотной культуры Rhodococcus rainbowensis и накопления астаксантина, а также разработка улучшенных рецептур культуральной среды. Для стимулирования роста Rhodococcus rainbowensis и накопления астаксантина будет проведено усовершенствование рецептуры культуральной среды и синергетическое воздействие физических и экологических факторов.

Кроме того, необходимо найти более простые и удобные способы предотвращения загрязнения Rhodococcus rainieri другими микроводорослями и враждебными организмами, а также предпринять попытки генной инженерии Rhodococcus rainieri, чтобы изменить его собственную биологию и сделать его более удобным для культивирования и применения.

 

Ссылки:

［1］ Nakagawa K, Kang S, Park D, et al . Ингибирование бета-каротином и астаксантином NADpH-зависимого микросомального перекисного окисления фосфолипидов [J]. JNutrit sci vitamin, 1997, 43:345.

［2］ Naguib Y M A. Антиоксидантная активность астаксантина и родственных каротиноидов［J］. JAgric Food Chem, 2000, 48:1150.

［3］ Tutujman SA, wamer w G, wei R R, et al . Быстрый жидкостный хроматографический метод для отличия дикого лосося от аквакультурного лосося, которого кормят синтетическим астаксантином［J］. JAOAC Int, 1997, 80:622.

［4］ Nishikawa Y, Minenaka Y, Ichimura M. Физиологические и биохимические эффекты каротиноидов (бета-каро-тин и астаксантин) на крыс［J］. Кашиэн Дайгку киё, 1997, 25:19.

[5] Barbosa M J, Morais R, choubert G. Влияние источника каротиноидов и содержания липидов в рационе на количество астакснинов в крови в зависимости от концентрации у радужной форели ( oncorhynchus mykiss) [J]. AquacuIture, 1999, 176: 331-341.

[6] Buttle LG, crampt0n Vo, Williams PD. The effect 0f feed pigment type0n flesh pigment dep0siti0n and c0l0ur in farmed Atlantic salm0n, salmo salar L [J]. . AquacuIture Res, 2001, 32:103~111.

[7] Amar E c, Kir0n V, Sat0h S, et al . Influence 0f vari0us dietary synthetic car0ten0ids 0n bi0-defence mechanisms in rainb0w tr0ut, onc0rhynchus mykiss (Walbaum) [J]. Aqua Research, 2001, 32:162~173.

[8] L0renz RT, cysewski GR. c0mmercialp0tentialf0rHaemat0c0ccus micr0algae as a natural s0urce 0f astaxanthin [J]. Tibtech, 2000, 18:160~167.

[9] or0sa M, Valer0JF, Herrer0c, et al . С0мпарис0н 0 накоплении астаксантина в Haemat0c0c- cuspluvialis и других зеленых микроводорослях при N-старвати0не и высокой освещенности [J] . .  Biotech Lett, 2001, 23:1079~1085.

[10] Tan S, cunningham FX, Y0umans M, et al . Цит0хр0ме-фл0сс в астаксантин-аккумулир0ванных красных клетк0х Haematococcus pluvialis (chl0r0phyceae) с0мпарис0н 0ф ф0т0синтетических ферментов и тилак0идные мем-браны пл0ипептидов в красных и зеленых клетках [J]. J of phycoIogy, 1995, 31: 897~905.

[11] B0ussibaS, V0nshakA. Astaxanthin accumulati0n in the green alga Haematococcupluvialis [J]. PIant and ceII physioIogy, 1991, 32: 1077~1082.

[12] K0bayashi M, Kakiz0n0T, Nagai S. Astaxanthin pr0ducti0n by a green alga, Haematococcus pluvialis acc0mpanied with m0rph0l0gical changes in acctate media [J]. J Ferm Bioeng, 1991, 71: 335~339.

[13] Lee Y K, Ding S Y. Cell cycle and accumulati0n 0f astaxanthin in Haemat0c0ccus Lacusiris (chlr0- phyta) [J]. J of phycoIogy, 1994, 30:445~449.

［14］ Zhuang Huiru, Lu Haisheng, Chen Bizhan, et al. Накопление астаксантина в трофических клетках красной водоросли Rhodococcus rainbowensis［J］. Журнал водной биологии, 2001, (7): 376~379.

[15] Barbera E, T0mas X, M0ya M J, et al . Тесты на значимость в исследовании 0специфической скорости гр0вта 0f Haemat0c0ccus Lacustris-влияния 0углеродного с0урса и интенсивности света [J]. J of Fermentation and Bioengineering, 1993, 76: 403~405.

［16］ Lee Y K, S0h c W. Accumulati0n 0f astaxanthin in Haematococcus lacusiris (chlr0phyta)［J］. J of

Фикология, 1991, 27: 575-577.

［17］ B0ussiba S, Bing W, Yuan JP, etal . Изменения в пигментном профиле у зеленой водоросли Haeamtococcusplu- vialis, подвергшейся стрессам [J]. Biotech Lett, 1999, 21:601~604.

Harker M, Y0ung AJ. Inhibiti0n 0f astaxanthin synthesis in the green alge, Haematococcus pluvialis ［18］ Harker M, Y0ung AJ. Inhibiti0n 0f astaxanthin synthesis in the green alge, Haematococcus pluvialis ［J］. EuroPean JournaI of phycoIogy, 1995, 30:179~187.

[19] Tjahj0n0 A E, Hayama Y, Kakiz0n0 T, et al . Гипераккумуляция астаксантина в зеленой водоросли Haematococcus pluvialis при повышенных температурах [J]. BiotechnoIogy Letters, 1994, 30: 133~138.

[20] Harker M, Tsavals A J, Y0ung AJ. Fact0r resp0nsible f0r astaxanthin f0rmati0n in the chl0r0phyte Haematococcus pluvialis [J]. Bioresource TechnoIogy, 1996, 55:207~214.

[21] SaradaR, Tripathi U, Ravishankar GA. Influence0f stress0nastaxanthin pr0ducti0n in Haematococ- cuspluvialis gr0wn under different culturec0nditi0ns [J]. Process Biochemistry, 2002, 37: 623-627.

[22] Harker M, Tsavals A J, Y0ung AJ. Use 0f resp0nse-surface meth0d0l0gy t00ptimize car0ten0genesis in the micr0alga Haematococcus pluvialis [J]. J of APPIied phycoIogy, 1995, 7: 399~406.

[23] G0ng X, chen F. optimizati0n 0f culture medium f0r gr0wth 0f Haematococcuspluvialis [J]. Jof AP- PIied phycoIogy, 1997, 9: 437~444.

[24] Fibs, 0minguez A, Regueir0M, et al . Оптимизация культуральной среды для культивирования микроводоросли Haematococcus pluvialis [J]. APPI MicrobioI BiotechnoI, 2000, 53: 530~535. ［25］ HataN, ogbonna Jc, Hasegawa Y, et al . Производство астаксантина Haematococcus pluvialis в последовательной гетеротрофно-фотоавтотрофной культуре [J]. J of APPI phycoIogy, 2001, 13:395~402.

［26］ Hagen c, Grunewald k, Xylander M, et al . Влияние параметров культивирования на рост и биосинтез пигментов в жгутиковых клетках Haematococcus pluvialis [J]. JAPPI phycoIogy, 2001, 13:79.

[27] Tripathi U, Sarada R, Ravishanker GA. Влияние условий культивирования на рост зеленой водоросли - Haema-.

tococcus pluvialis и производство астаксантина［J］. Acta physioIogiae pIantarum, 2002, 24: 323~329. ［28］ Boussiba S, Fan L, vonshakA. Усиление и определение накопления астаксантина в зеленой Водоросли Haematococcus pluvialis［J］. Meth EnzymoI, 1992, 213: 386~391.

[29] Lu F, vonshakA, Boussiba S. Влияние температуры и облучения на рост Haematococcus plu- vialis (chlorophyceae) [J]. J of phycoIogy, 1994, 30: 829~833.

[30] Fan L, vonshak A, Boussiba S. Влияние температуры и облучения на рост Haematococcus pluvialis (chlorophyceae) [J]. J of phycoIogy, 1994, 30: 829~833.

［31］ BorowitzkaMA, Huisman JM, osborn A. культура астаксантин-продуцирующей зеленой водоросли Haemato- coccus pluvialis.  Влияние питательных веществ на рост и тип клеток [J]. J of APPIied phycoIogy, 1991, 3: 295 ~304.

[32] kobayashi M, kurimuraY, Tsuji Y. Светонезависимое производство астаксантина зеленой микроводорослью

Haematococcus pluvialis в условиях солевого стресса［J］. Biotech Lett, 1997, 19: 507~509. ［33］ Qiu Baosheng, Liu Qifang. Улучшение культуральной среды для Rhodococcus rainbowensis［J］. ［33］ Цюй Баошэн, Лю Цифан. Усовершенствование среды для культивирования Rhodococcus rainbowensis［J］.

［34］ Fibregas J, otero A, Maseda A, et al. Двухэтапные культуры для производства астаксантина из Haematococcus pluvialis［J］. Двухступенчатые культуры для производства астаксантина из Haematococcus pluvialis [J]. JournaI of BiotechnoIogy, 2001, 89:65~71.

［35］ Zhuang Huiru, Chen Bizhan. Смешанная питательная и гетеротрофная культура Rhodococcus rainieri［J］. Вестник микробиологии, 2000, (3): 198~201.

［36］ kobayashi M, kakizonoT, NagaiS. Усиленный биосинтез каротиноидов в результате окислительного стресса в клетках цисты зеленой одноклеточной водоросли, вызванного ацетатом. Haematococcus pluvialis [J]. APPIied and EnviromentaI MicrobioIogy, 1993, 59: 867~873.

[37] orosaM, Franqueira D, cid A, et al. Carotenoid accumulation in Haematococcuspluvialis in mixotro- phic growth [J]. Накопление каротиноидов в Haematococcuspluvialis при миксотро-фическом росте [J]. Biotech Lett, 2001, 23:373-378.

［38］ JIN Chuan-Yin, SONG Li-Rong, LIU Yong-Ding, et al. Выбор культуральной среды и потребность в витамине B12 у красной водоросли Haematococcus sp. HB748［J］. Журнал прикладной и экологической биологии, 1997, (3): 177~179.

［39］ Gong X D, chen F. Влияние компонентов среды на содержание астаксантина и производство Haematococcus pluvialis［J］. Pro Biochem, 1998, 33:385~391.

［40］ JIN Chuan-Yin, SONG Li-Rong, LIU Yong-Ding, et al. Питательные потребности водного 748 штамма Rhodococcus rubra[J]. Журнал водной биологии, 1996, 20:293~296.

［41］ olaizola M. Коммерческое производство астаксантина из Haematococcus pluvialis с использованием 25 000-литровых открытых фотобиореакторов［J］. JAPPI phycoI, 2000, 12:499~506.

[42] Grunewald k, Hagen c. Экструзия вторичных каротиноидсодержащих везикул из жгутиконосцев.

Haematococcus pluvialis (volvocales; chlorophyceae) [J]. J of APPI Botany-Angewandte Botanik, 2000, 74: 141~144.