Как ультразвук влияет на эффективность извлечения астаксантина из панциря креветки? 0 Введение

 Китайская креветка (Fenneropenaeus chinensis), также известная как восточная креветка, относится к отряду Arthropoda, Crustacea, Decapoda, Prawns, Prawns, вместе с мексиканской коричневой креветкой, гайанской белой креветкой, известной как три знаменитые креветки в мире, является наиболее широко распространенным в Китае видом креветок. Китайская креветка - важный экспорт водных продуктов Китая, широко приветствуемый на международном рынке. Китайская креветка в основном распространена в Желтом море и на побережье Бохайского моря, основными районами производства являются Ляонин, Хэбэй, Шаньдун и Тяньцзинь. В последние годы китайская индустрия аквакультуры креветок быстро развивается, и в 2015 году общее количество креветок, выращенных в Китае, достигло 44 800 тонн [1], что принесло достаточное количество сырья для креветочной промышленности, но также произвело большое количество отходов переработки креветок, таких как головы и панцири креветок.

Исследования показали, что пигменты панциря креветок представлены каротиноидами, в основном состоящими из свободного астаксантина и эфиров астаксантина, которые составляют от 63,5 до 92,2 % от общего количества каротиноидов в панцире креветок в зависимости от вида креветок [2]. Астаксантин - это кетосодержащий каротиноид, химически известный как 3,3'-дигидрокси-4,4'-β, β'-каротин (рис. 1), который широко распространен в водных животных, таких как креветки, крабы и лососевые [3]. Они широко распространены в водных животных, таких как креветки, крабы и лососевые [3], и привлекли внимание благодаря своей превосходной антиоксидантной [4], противораковой, противоопухолевой и укрепляющей иммунитет активности [5].

 

Поскольку астаксантин в панцирях креветок в основном находится в форме комплекса астаксантин-белок, эффективность прямой экстракции растворителем низка, поэтому для разрушения структуры комплекса астаксантин-белок обычно используются физические или химические методы, а затем для извлечения астаксантина из панцирей креветок применяется экстракция растворителем [6]. Ключ к экстракции астаксантина из панцирей креветок лежит в разделении астаксантина и белково-связывающих структур, и на этом принципе основаны щелочная экстракция, ферментативное сбраживание, ферментация или сочетание нескольких методов [7-9]. Принцип отделения астаксантина от белковой структуры основан на денатурации или деградации белка, а для денатурации или деградации белков существует множество способов. Многократное замораживание и оттаивание - это широко используемый физический метод разрушения клеток ткани, который прост в эксплуатации. Материал многократно замораживают при температуре -15~-20°C, затем медленно оттаивают при комнатной температуре и так далее, что приводит к разрушению большинства клеток и частиц внутри клеток. Учитывая низкую эффективность извлечения астаксантина из креветочных панцирей путем прямой экстракции растворителем, а также неполное разрушение комплексов астаксантин-белок при обработке паром, сверхвысоким давлением и ультразвуком [10], в данном эксперименте для извлечения астаксантина из креветочных панцирей использовались нагрев и обработка паром в сочетании с модифицированным методом многократного замораживания-оттаивания, чтобы добиться более высокой эффективности извлечения.

 

1 Экспериментальные материалы и методы

1.1 Материалы и инструменты

Панцири креветок, предоставленные лабораторией, представляли собой свежие китайские креветки, приобретенные на оптовом рынке водных ресурсов Jinzhou Linxi Road, доставленные в лабораторию на льду, вручную очищенные от панцирей, промытые водопроводной водой и осушенные.

Астаксантин стандартный (чистота астаксантина 97,8%; Dr. Ehrenstorfer, Германия); метанол, ацетонитрил (хроматографический класс, Tianjin Damao Chemical Reagent Factory); все остальные реактивы были аналитически чистыми. Высокоэффективный жидкостный хроматограф P680 (с DAD-детектором, Dionex, США); электронные весы FA2004 (Shanghai Hengping Scientific Instrument Co., Ltd.); Ротационный испаритель RE-2000 (Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory); ультразвуковой волновой очиститель с числовым программным управлением KQ-400KDE (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); дозатор сверхчистой воды PS02-AD-DI (Shanghai Xunhui Environmental Protection Technology Co., Ltd.);  циркуляционный водяной вакуумный насос SHZ-D(Ⅲ) (Shanghai Shenguang Instrument Co., Ltd.).

 

1.2 Методы испытаний

1.2.1 Условия обнаружения с помощью жидкостной хроматографии

Разделение проводилось на колонке DevelosilC30 (метанол:ацетонитрил (80∶20, v/v)) при 30 ℃ со скоростью потока 0,8 мл/мин при длине волны 476 нм и объеме впрыска 20 мкл.

 

1.2.2 Построение стандартных кривых

Для приготовления серии стандартных образцов астаксантина и стандартной кривой использовался метод, описанный Сунь Сецзюнем [11].

 

1.2.3 Расчет степени извлечения астаксантина

Скорость экстракции астаксантина (мкг/г) = концентрация астаксантина в экстракционном растворе (мкг/мл) × объем (10 мл) / масса порошка панциря креветки (г)

 

1.3 Тест на экстракцию астаксантина

1.3.1 Выбор оптимального времени приготовления

Свежие панцири креветок варили в кипящей воде в течение 1~8 мин, затем вынимали, сливали воду, измельчали в кофемолке и пропускали через сито с 40 ячейками. Точно взвесив 0,2000 г порошка креветок с разным временем варки, поместили его в коническую колбу объемом 100 мл, добавили 60 мл раствора дихлорметана, экстрагировали при магнитном перемешивании при комнатной температуре в течение 15 мин, отфильтровали под пониженным давлением и промыли остаток в колбе равным объемом экстракционного растворителя. После выпаривания большей части растворителя ротационным выпариванием при 45 ℃, фильтрат растворяли в дихлорметане и доводили объем до 10 мл, затем фильтровали через мембрану 0,45 мкм и измеряли концентрацию астаксантина методом ВЭЖХ для расчета степени извлечения астаксантина. Каждый тест повторяли три раза, а растворители для экстракции содержали 0,05% 2,6-ди-терт-бутил-п-крезола (BHT).

 

1.3.2 Выбор оптимального растворителя

Точно взвешивают 0,2000 г панцирей креветок, помещают в 100 мл закрытую коническую колбу, добавляют дихлорметан, метанол, этилацетат, метанол, метанол/дихлорметан (2:1, в/в), метанол/дихлорметан (1:1, в/в) по 60 мл каждого раствора, при комнатной температуре, экстрагируют магнитным перемешиванием в течение 30 мин, последующие этапы с 1.3.1, сравнивают скорость экстракции астаксантина.

 

1.3.3 Ультразвуковая экстракция

Используя экстракционный растворитель, полученный в п. 1.3.2, в условиях пропаривания в п. 1.3.1, свежие креветочные панцири варили в кипящей воде в течение соответствующего периода времени, затем вылавливали и сливали, а слитые креветочные панцири помещали в холодильник при -18 ℃ для замораживания на 10 мин, а затем измельчали в растительной кофемолке и пропускали через сито с 40 ячейками. Взвесьте 0,3000 г порошка из панциря креветки в 100 мл конической колбе, добавьте 90 мл метанола / дихлорметана (2:1; v/v) раствора, ультразвуковой ударной экстракции в течение определенного периода времени, экстрагированная смесь декомпрессионной фильтрации, равный объем экстрагирующего растворителя, чтобы промыть остаток в колбе фильтрации. После выпаривания большей части растворителя при 45 ℃, фильтрат растворяли в метаноле/дихлорметане (2:1, v/v) и фиксировали до 10 мл, затем фильтровали через мембрану 0,45 мкм, концентрацию астаксантина измеряли методом ВЭЖХ, рассчитывали скорость экстракции астаксантина.

(1) Выбор оптимальной мощности ультразвука. Фиксированное соотношение жидкости и твердого вещества 20 мл/г, время экстракции 30 мин, выберите мощность ультразвука 200, 240, 280, 320, 360 и 400 Вт для испытания, затем выполните те же действия, что и в п. 1.3.3, и сравните скорость экстракции астаксантина.

(2) Выбор оптимального соотношения жидкости и твердого вещества. При оптимальных условиях питания, полученных в вышеуказанном испытании, время экстракции было выбрано равным 30 мин, и испытание проводилось в условиях соотношения жидкости и твердого вещества 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мл/г, а последующие этапы были такими же, как в п. 1.3.3, и сравнивалась скорость экстракции астаксантина.

(3) Выбор оптимального времени ультразвукового воздействия. При оптимальных условиях мощности и соотношения жидкости и твердого тела, полученных в вышеуказанном однофакторном испытании, экстракцию проводили в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин, соответственно, и последующие этапы были такими же, как в п. 1.3.3, и сравнивали скорость экстракции астаксантина.

 

1.3.4 Ультразвук в сочетании с повторной экстракцией замораживанием-размораживанием после пропаривания

Свежие креветочные панцири варили в кипящей воде в течение 5 минут, затем вылавливали и сливали воду, после слива креветочные панцири помещали в морозильную камеру -18 ℃ на 30 минут, а затем немедленно измельчали с помощью дробилки, и измельченный порошок креветочных панцирей экстрагировали в течение определенного периода времени при оптимальных условиях ультразвуковой экстракции, как описано в разделе 1.3.3, а затем экстракт фильтровали под пониженным давлением, концентрировали и затем помещали в холодильник -18 ℃ для временного хранения. В то же время, остаток креветочных панцирей после ультразвуковой экстракции был заморожен в -18 ℃ холодильнике в течение определенного периода времени, а затем достали и оттаивали в течение определенного периода времени при комнатной температуре, и замороженные и оттаявшие креветочные панцири были помещены в закупоренные конические колбы, а затем экстрагировали в тех же условиях с помощью ультразвуковых волн, фильтровали под пониженным давлением, а затем концентрировали, а затем объединили с концентрированным раствором первой ультразвуковой экстракции, а затем сушили в течение 24 ч, а затем получили сырые экстракты астаксантина, и содержание астаксантина было определено методом ВЭЖХ, и скорость извлечения астаксантина была рассчитана.

(1) Выбор оптимального времени замораживания. Первое время замораживания было установлено на 1, 2, 3, 4 и 5 ч, время оттаивания составляло 5 мин, замораживание и оттаивание повторялось один раз, остальные этапы экстракции были такими же, как в п. 1.3.3, и сравнивалась скорость экстракции астаксантина.

(2) Выбор оптимального времени оттаивания. Приняв вышеуказанное оптимальное время замораживания, установите время оттаивания на 6, 8, 10, 12 и 14 мин, повторите замораживание и оттаивание один раз, остальные этапы экстракции были такими же, как в п. 1.3.3, и сравните скорость экстракции астаксантина.

(3) Выбор оптимального количества циклов замораживания-оттаивания. При оптимальных условиях времени замораживания и оттаивания количество повторных операций замораживания-оттаивания составляет 1, 2, 3 и

4 раза, остальные этапы экстракции были такими же, как в п. 1.3.3, и сравнивалась степень извлечения астаксантина.

 

2 Результаты испытаний и анализ

2.1 Хроматографическое разделение астаксантина из панциря креветки и построение стандартной кривой

Стандартный раствор астаксантина и экстракция астаксантина из панцирей китайских креветок

Жидкостные хроматограммы растворов представлены на рисунках 1(a) и 1(b), а уравнение регрессии концентрации астаксантина на площадь пика было получено следующим образом: y=0,25x+0,56, R2=0,9993, где y - концентрация астаксантина (мкг/мл), а x - площадь пика (мАU).

 

2.2 Влияние времени варки на выход астаксантина

В живых креветках астаксантин существует в трех формах: α, β и γ. После снятия панцирей с живых креветок содержание астаксантина β-типа увеличивается и становится основной формой астаксантина, который является своего рода димером с α-спиралью в качестве основной вторичной структуры, и вторичная структура будет разрушена при нагревании до 40℃ или выше, что приводит к необратимости белка［12］. Астаксантин и астаксантин в креветочных панцирях ковалентно связаны, и комплекс астаксантин-белок является водорастворимым, а термическая денатурация астаксантина высвобождает астаксантин, который может быть извлечен из порошка креветочных панцирей органическими растворителями.

Количество астаксантина, выделяемого при разном времени кипячения, было различным (см. рис. 2), с увеличением времени кипячения количество астаксантина, экстрагированного из порошка панциря креветки, становилось все больше и больше, но после более чем 5 мин скорость экстракции астаксантина постепенно снижалась, стабильность свободного астаксантина была очень низкой, и потери астаксантина увеличивались после определенного периода времени воздействия кипящей воды, что приводило к снижению скорости экстракции. Поэтому для испытания было выбрано кипячение в течение 5 минут.

 

2.3 Влияние растворителя на скорость экстракции астаксантина

Влияние растворителей на эффективность экстракции астаксантина показано на рис. 3. Эффективность экстракции различными растворителями была следующей: метанол/дихлорметан (2:1, v/v) > метанол/дихлорметан (1:1, v/v) > дихлорметан > метанол > этилацетат > этанол, причем астаксантин креветок в основном существовал в свободной форме, а смесь метанола и дихлорметана давала лучшие результаты экстракции [11]. Смесь метанола и дихлорметана оказалась более эффективной [11], а высокая доля метанола способствовала лучшему пропитыванию порошка креветочного панциря растворителем, что повысило эффективность экстракции. Поэтому в следующих экспериментах в качестве растворителя для экстракции использовали метанол/дихлорметан (2:1, v/v).

 

2.4 Результаты испытаний ультразвуковой экстракции после пропаривания

2.4.1 Влияние мощности ультразвука на степень извлечения астаксантина

Основной принцип взаимодействия ультразвука со средой состоит из трех аспектов: нагрев, вибрация и кавитация, а влияние ультразвука на микроструктуру образца в основном обусловлено кавитационным эффектом ультразвука, который усиливается с увеличением мощности и может влиять на стабильность экстрактов [13].

Влияние мощности ультразвука на скорость извлечения астаксантина показано на рис. 4. После того как мощность ультразвука достигает 320 Вт, скорость извлечения астаксантина снижается, а на стабильность астаксантина влияет повышение температуры воды в ультразвуковом очистителе и усиление кавитации, поэтому для испытания была выбрана мощность ультразвука 320 Вт.

 

2.4.2 Влияние соотношения жидкости и твердого вещества на скорость экстракции астаксантина

Экспериментальные результаты влияния соотношения жидкости и твердого тела на скорость экстракции астаксантина представлены на рис. 5.

Как показано на рисунке 5, когда соотношение жидкость-твердое вещество превышало 20 мл/г, увеличение выхода астаксантина снижалось с увеличением соотношения жидкость-твердое вещество; более высокое соотношение жидкость-твердое вещество могло способствовать растворению астаксантина, повышению эффективности экстракции и облегчению операции фильтрации под пониженным давлением. Однако более высокое соотношение жидкость-твердое тело увеличивало время операции последующего этапа концентрирования, что приводило к увеличению времени удержания экстракта астаксантина в окружающей среде, вызывая определенную потерю астаксантина, и увеличение выхода астаксантина было ограничено. По результатам эксперимента было установлено, что соотношение жидкости и твердого вещества 20 мл/г является более подходящим для проведения эксперимента.

 

2.4.3 Влияние времени воздействия ультразвука на степень извлечения астаксантина

Как показано на рис. 6, содержание астаксантина увеличивалось, а затем уменьшалось с увеличением времени, и 40 мин было принято за оптимальное время экстракции. Сочетание двух оптимизированных параметров процесса - варки и ультразвуковой обработки - позволило значительно повысить содержание астаксантина в панцирях креветок при оптимальных условиях, а максимальное содержание астаксантина, извлеченного ультразвуком из панцирей креветок, составило 21,3 мкг/г.

 

2.5 Результаты испытаний в повторных условиях метода замораживания-оттаивания

На основе частичной денатурации белков панциря креветки, вызванной кипячением и ультразвуковой обработкой, была использована комбинация замораживания и оттаивания. В процессе замораживания панцирей креветки при температуре -18℃, внутреннее замораживание воды в панцирях креветки из-за фазового изменения воды в панцирях креветки и связывания воды привело к дальнейшей денатурации белков панциря креветки, и последующий естественный процесс оттаивания, растворение замороженной воды не могло быть поглощено белками панциря креветки полностью, что привело к потере части свободной воды и небольшого количества потока связывающей воды. После повторных операций замораживания и оттаивания степень разрушения сложной структуры белка и астаксантина в панцирях креветок увеличивалась [14], доля свободного астаксантина возрастала, а эффективность извлечения астаксантина еще больше увеличивалась.

Из рисунков 7-9 видно, что с увеличением времени замораживания содержание астаксантина постепенно увеличивалось, а затем выравнивалось, поэтому для эксперимента было выбрано время замораживания 3 ч, и в это время содержание астаксантина составляло 36,7 мкг/г; с увеличением времени размораживания содержание астаксантина увеличивалось, а затем уменьшалось, и для эксперимента было выбрано время размораживания 8 мин, и содержание астаксантина уменьшалось после трехкратного повторения замораживания и размораживания, поэтому оптимальными условиями замораживания и размораживания были выбраны 3 ч, 8 мин и 3 раза повторное замораживание и размораживание. Таким образом, 3 ч замораживания, 8 мин оттаивания и 3 раза повторного замораживания и оттаивания были выбраны в качестве оптимальных условий после замораживания и оттаивания, при которых содержание астаксантина достигло 39,6 мкг/г.

 

3 Заключение

Астаксантин извлекали из панцирей креветок комбинацией ультразвукового метода и многократного замораживания-оттаивания, используя метанол/дихлорметан (2/1, v/v) в качестве растворителя для экстракции. Оптимальное время варки панцирей креветок составило 5 мин, оптимальная мощность ультразвуковой экстракции - 320 Вт, соотношение жидкости и твердого вещества - 20 мл/г, время ультразвуковой экстракции - 15 мин, время замораживания - 3 ч, время плавления - 8 мин, трехкратное замораживание-оттаивание - до 39,6 мкг/г. Результаты показали, что экстрагированные панцири креветок имели наилучшую эффективность экстракции. Содержание астаксантина достигло 39,6 мкг/г.

 

Ссылки:

[1] Бюро рыболовства, Министерство сельского хозяйства .2016 Китайский статистический ежегодник рыболовства [М]. Пекин: Китайская сельскохозяйственная пресса, 2016.

[ 2 ] Sachindra N M, Bhaskar N, Mahendrakar N S. Carotenoids in different body components of Indian shrimps［J］.J Sci Food Agric, 2005（ 1）:167-171.

[ 3 ] Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L, Goycoolea F M. Astaxanthin: A review of its chemistry and applications ［J］. Crit Rev Food Sci Nutr, 2006, 2: 185-196.

[4] Yuan Lei, Liu Xiaogeng, Tang Yu. Сравнение способности различных каротиноидов к поглощению свободных радикалов［J］. Упаковка и пищевое оборудование, 2015, 33(2):7-11.

[5] LIU Lian, LIU Fang, CHEN Xiaoyan, et al. Противоопухолевый эффект астаксантина и его механизм［J］. Журнал Фошаньского института науки и техники (естественнонаучное издание), 2015, 33(4): 5-8.

[6] ZHAO Yi, CHEN Xingcai. Экстракция и очистка астаксантина из панцирей креветок［D］. Фучжоу: Университет Фучжоу, 2006.

[7] DU Chunlin. Исследование процесса извлечения астаксантина из раковин Litopenaeus vannamei (L. vannamei) ［J］. Jiangsu Agricultural Science, 2009(2):225-227.

[8] WANG Yin, HU Tingting, WU Chengye. Определение и оптимизация условий экстракции астаксантина из панцирей креветок［J］. Fujian Agricultural Journal, 2013, 28(10): 1045-1049.

[9] Wang Guangxiang. Метод получения хитина, астаксантина и белка из свежих креветочных панцирей . Патент Китая: 02122565.6 [P] 2005-01-12.

[10] X. Tian. Влияние обработки паром и сверхвысоким давлением на изменение качества южноамериканских белых креветок [D]. Цзиньчжоу: Бохайский университет, 2016.

[11] SUN Xiejun, HU Hao, LI Xiuxia, et al. Ультразвуковая экстракция астаксантина из китайских креветок [J]. Упаковка и пищевое оборудование, 2015, 33(5): 13-18.

[12] Pan Chuang, Ishizaki S, Ji Hongwu, et al. Исследование природы астаксантина в панцире южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei)［J］. Журнал Даляньского океанического университета, 2014, 29(3): 276-280.

[13] CHEN Xiaoming, LI Kaimian, TAI Jianxiang, et al. Ультразвуковая экстракция активных веществ из кожуры маниока［J］. Журнал сельскохозяйственной инженерии, 2011, 27(1): 389-396.

[14] JIANG Qingqing, LIU Wenjuan, LU Jun, et al. Прогресс в исследовании влияния замораживания и размораживания на качество мяса［J］. Наука и технология пищевой промышленности, 2015, 36(8):384-389.