Исследование дополнительной ферментации для производства астаксантина дрожжами Fife

 Аннотация: Дополнительное брожение для получения астаксантина проводили с использованием дрожжей Файфа (pha『ia rhodozyma) Wss-FF6 в качестве бактерии-продуцента при скорости аэрации 250 л/ч, pH = 6 . 0 ± 0 . 5, в среду сначала добавляли проточный раствор с высокой концентрацией сахара, а затем 0,5% этанола. Через 130 ч ферментации выход биомассы и каротиноидов составил 27,4 мг/мл и 26,4 мг/мл, соответственно. Через 130 ч ферментации биомасса и выход каротиноидов составили 27,4 мг/мл и 26,12 мкг/мл, соответственно. После 130 ч ферментации выход биомассы и каротиноидов составил 27,4 мг/мл и 26,12 мкг/мл, соответственно. Скорость роста, выход продукта и массовая доля дрожжевого пигмента составляли 0,46, 0,44 и 0,12 мкг/мл соответственно. 0,46, 0,44 и 0,95 . 95 .

 

Дрожжи Фифе (Pha'ia rhodozyma) считаются наиболее вероятным методом промышленного брожения для получения астаксантина, производство астаксантина на дрожжах Pha'ia rhodozyma В последние годы изучение производства астаксантина на дрожжах Pha'ia rhodozyma стало предметом внимания отечественных и зарубежных исследователей. Дрожжи Fife проявляют ЭФФЕКТ КРАБТРИ в процессе ферментации [1, 2].

 

Поэтому для дрожжей Fife биомасса на единицу ферментационного бульона может быть реализована при простой порционной ферментации, что является отличным штаммом для производства астаксантина методом промышленной ферментации, и изучению производства астаксантина дрожжами Fife уделяется внимание отечественными и зарубежными исследователями в последние годы. Дрожжи Fife проявляют ЭФФЕКТ КРАБТРИ в процессе ферментации [1, 2], поэтому для дрожжей Fife биомасса и пигментация на единицу ферментационного бульона ниже, чем при простой порционной ферментации, и трудно увеличить коэффициент скорости роста субстрата и коэффициент выхода продукта.

Авторы использовали в качестве исходной бактерии мутантный штамм Wss-FF6, полученный в результате лабораторного скрининга [3], и изучили его добавки и процесс порционной ферментации, надеясь повысить эффективность ферментации, чтобы дать некоторые рекомендации для промышленного производства.

 

1 Материалы и методы

1 . 1 Основные инструменты

Настольный ферментер объемом 2 л, производство INFER, Швейцария.

 

1 . 2 Штаммы

Дрожжи Файфа WSS-FF6 [3], хранящиеся в лаборатории автора. 1 . 3 Культуральная среда

 

1 . 3 . 1 Наклонная среда YM

Среда (г/л): глюкоза 10, сусло 3, пептон 5, дрожжевая паста 3, агар 20; pH 6 . 0 .

 

1 .3 . 2 Среда для культивирования семян

Глюкоза 10 г/л, сусло 3 г/л, пептон 5 г/л, дрожжевая паста 3 г/л; pH 6 . 0 .

 

1 . 3 . 3 Среда для встряхивания колбы

глюкоза 20 г/л, (NH4 )2 SO4 5 г/л, KH2 PO4 1 г/л, MgSO4 - 7H2 O 0 . 5 г/л, cacl2 -2H2 O 0 . 1 г/л, дрожжевая паста 1 г/л; PH 6 . 0 .

 

1 .3 . 4 Средства массовой информации с добавлением потока  

Увеличенная в 7,5 раз массовая концентрация каждого компонента вышеуказанной среды для встряхивания колбы. В 5 раз .

 

1 . 4 Методы культивирования

1 . 4 . 1 Методы культивирования семян

Ферментацию проводили в треугольной колбе объемом 250 мл, содержащей 25 мл посевной среды при 22 ℃, 220 об/мин в течение 48 ч. 2 мл этого ферментационного бульона (10% от инокулята) добавляли в треугольную колбу объемом 250 мл с 23 мл среды для встряхивания при 22 ℃, 220 об/мин в течение 48 ч. Ферментацию проводили при 22 ℃ в течение 48 ч.

 

1 .4 . 2 Метод культивирования в колбе-трясучке  

Инокулят 10%, 25 мл в треугольных бутылках объемом 250 мл, инкубировали при 22 ℃, 220 об/мин в течение 72 ч. Инокулят 10%, 25 мл в треугольных бутылках объемом 250 мл.

1 . 4 . 3 Методы культивирования в ферментере  

Объем закваски составляет 10%, объем загрузки - 1 . 2 Л, 20 ~ 22 °C . 1 . 5 Метод измерения

 

1 . 5 . 1 Определение биомассы  

Для метода определения сухого веса культуральную среду центрифугировали, промывали один раз дистиллированной водой, снова центрифугировали и высушивали в печи при 105 °C до постоянного веса.

 

1 .5 . 2 Определение общего содержания каротиноидов  

Метод диметилсульфоксида (ДМСО) [4]. 2 мл ферментационного бульона разбивали на 1 мл ДМСО. 2 мл ферментационного бульона разбивали на 1 мл ДМСО, добавляли 5 мл ацетона для прямой экстракции и измеряли абсорбцию при λmax = 480 нм с V(ацетон): V(ДМСО) = 5 : 1 в качестве холостого опыта.

 

2 Результаты и обсуждение

2 . 1 Контроль влияния PH на ферментацию

Значение pH среды влияет на заряд клеточной мембраны и степень ионизации питательных веществ в среде, тем самым влияя на рост и производство микроорганизмов. В отличие от культур в шейкфляжах, культуры в ферментерах более эффективно контролируют рН в процессе ферментации, чтобы дрожжи росли в оптимальной рН-среде. На рис. 1 показано значение pH при ферментации с 0,2 моль/л дигидрогенфосфата натрия (NaOH). На рис. 1 показано значение pH дрожжей, выращенных в 0,2 моль/л дигидрогенфосфата натрия и 0,1 моль/л лимонной кислоты. На рис. 1 показаны результаты культивирования дрожжей в буферной системе с 0,2 моль/л дигидрогенфосфата натрия и 0,1 моль/л лимонной кислоты [5], которая регулировала значение pH среды для культивирования дрожжей до 3, 4, 5, 6, 7 и 8, соответственно.

 

Видно, что поддержание относительно стабильного значения pH в процессе ферментации благоприятно для увеличения биомассы и пигментации, причем влияние на биомассу более очевидно. При оптимальном значении рН 6 биомасса "системы с забуференным рН" увеличилась почти вдвое по сравнению с "системой с исходным рН", в то время как существенной разницы в количестве пигментации не наблюдалось. Такое влияние pH на биомассу Saccharomyces cerevisiae согласуется с результатами исследования HO et al. (1999) [6].  2 . 2.2 Влияние аэрации на ферментацию Ферментацию проводили на среде колбы-встряхивателя в качестве базовой среды, кривые хода ферментации при различных уровнях аэрации представлены на рис. 2, а результаты влияния аэрации на ферментацию, полученные на основе рис. 2, приведены в табл. 1.

 

Кривые процесса показали, что ферментация дрожжей была одинаковой при всех трех скоростях аэрации, но при 75 л/ч дрожжи раньше вступали в логарифмическую фазу роста, а количество дрожжевой пигментации начинало уменьшаться через 90 ч, что может быть связано с автолизом дрожжей [7]. Сравнивая данные, приведенные в таблице 1, легко заметить, что более эффективным является использование скорости аэрации 250 л/ч и более.

 

2 . 3 Влияние массовой концентрации исходной глюкозы на ферментацию

YAMANE et al. (1997) показали, что ферментация дрожжей Файфа ATCC24202 при высокой концентрации растворенного кислорода (DO = 5,0 мг/л) подавляла действие эффекта Кребутери. (DO = 5,0 мг/л) может ингибировать эффект Кребтри, так что дрожжи не производят побочные продукты метаболизма, такие как этанол, глицерин, ацетат, пируват и т.д., при культивировании на различных средах с различной начальной массовой концентрацией глюкозы от 10 до 120 г/л. Однако максимальная удельная скорость роста дрожжей снижалась с увеличением начальной массовой концентрации сахара, а также была обнаружена взаимосвязь между средами с различной массовой концентрацией сахара, то есть среда с низкой массовой концентрацией сахара была благоприятной для ферментации дрожжей Fife ATCC24202. Была обнаружена взаимосвязь между различными концентрациями сахара, то есть среда с низкой массовой концентрацией сахара была благоприятна для роста дрожжей, в то время как среда с высокой массовой концентрацией сахара была благоприятна для производства пигмента. Поэтому авторы использовали низкую концентрацию сахара (т.е. низкое соотношение углерода и азота - 2,8 моль глюкозы/1 моль сульфата аммония) в сочетании с изменением азота в среде. 8 моль глюкозы/1 моль сульфата аммония), а затем с высоким содержанием сахара (11,2 моль глюкозы/1 моль сульфата аммония). Авторы использовали двухступенчатую периодическую ферментацию с низким содержанием сахара (т.е. с низким соотношением углерода и азота 2,8 моль глюкозы/1 моль сульфата аммония) и последующим высоким содержанием сахара (11,2 моль глюкозы/1 моль сульфата аммония) и получили хорошие результаты [1]. Авторы провели эксперименты по ферментации с различными исходными концентрациями глюкозы при аэрации 250 л/ч. Кривые процесса представлены на рис. 3, а влияние различных исходных концентраций глюкозы на ферментацию - в табл. 2.

Кривые процесса показали, что при условии аэрации 250 л/ч состояние ферментации было одинаковым для различных начальных концентраций сахара, но время ферментации удлинялось с увеличением концентрации сахара, что согласуется с экспериментальными результатами Ямане и др. (1997) [1].

 

Анализируя показатели роста и выхода продукта в таблице 2, можно заметить, что тенденции обоих показателей совпадают, и оба они уменьшаются с увеличением массовой концентрации исходного сахара, что означает, что ферментация с низкой массовой концентрацией сахара благоприятна для увеличения биомассы и пигментации, что отличается от выводов YAMANE, описанных выше. В сочетании с экспериментальными результатами из литературы [2], легко обнаружить, что скорость роста субстрата и выход продукта в культуре встряхивания колбы в 2~3 раза ниже, чем в резервуарной культуре с той же концентрацией сахара, потому что трудно контролировать количество аэрации, что отражает важность кислорода в ферментации дрожжей Фифа. Однако при сравнении массовой доли каротиноидов (ΔP/ΔX на единицу цитохрома) двух культур было обнаружено, что количество цитохрома на единицу той же концентрации сахара в колбах для встряхивания было примерно в 1 раз выше, чем в резервуарах для брожения. Этот результат не только доказывает, что этанол способствует накоплению красителей, но и подтверждает вывод, сделанный YA-Mane и др. о непродуцировании этанола дрожжами Фифе в условиях высокого содержания кислорода, растворенного в диапазоне определенной концентрации сахара. Это также подтверждает вывод YA-MANE et al.

 

2 . 4 Влияние массовой концентрации этанола на ферментацию

Хотя этанол как единственный источник углерода оказывает сильное ингибирующее действие на рост дрожжей Файфа, добавление соответствующего количества этанола в культуральную среду может повысить активность этанолдегидрогеназы и метилглутарат-моноацил-коэнзим А редуктазы в пути синтеза астаксантина, а значит, благоприятно для увеличения количества пигмента на единицу клетки [8], что было продемонстрировано в экспериментальных результатах в литературе [2]. Используя этот эффект этанола, Ямане и др. (1997) [9] добавили 0,3% этанола к клеткам во время стабильной фазы роста. (1997) [9] добавляли 0,3% этанола во время стабильной фазы роста клеток, а Гу и др. (1997) [10] добавляли 0,2% этанола во время поздней задержки или логарифмической фазы роста. (1997) [10] добавляли 0,3 % этанола на стадии поздней задержки или логарифмического роста, и Гу и др. (1997) [10] увеличили выход пигмента примерно в 1 раз.

 

Чтобы исследовать влияние этанола на WSS-FF6, мы использовали среду для встряхивания колбы в качестве основы, и заменили всю глюкозу в среде различными концентрациями этанола или добавили различные количества этанола к исходной среде для проведения ферментации в встряхивании колбы, и результаты эксперимента приведены в таблице 3. Результаты приведены в таблице 3. Видно, что при использовании этанола исключительно в качестве источника углерода и концентрации этанола ≤10 г/л этанол играл только роль общего источника углерода и не способствовал накоплению астаксантина. С другой стороны, добавление 1,0 г/л этанола в присутствии глюкозы не влияло на накопление астаксантина. В присутствии глюкозы добавление 1,0 г/л этанола устраняло ингибирующий эффект на рост дрожжей WSS-FF6, а количество каротиноидов было в 1,1 раза выше, чем у дрожжей без этанола. Качественная фракция каротиноидов была в 1,1 раза выше, чем в дрожжах без этанола.

 

2 . 5 Двухэтапная ферментация с порционным пополнением

Учитывая вышеизложенные результаты, ферментацию проводили с 20 г/л глюкозы в среде встряхиваемой колбы при pH 6 ± 0,5 (капельный контроль 2 моль/л NaoH) и 250 г/л аэрации. В условиях pH 6 ± 0,5 (капельный контроль 2 моль/л NaoH) и аэрации 250 г/л были проведены одноэтапная пополняющая ферментация только с проточной средой и двухэтапная пополняющая ферментация с 0,1 г/дл этанола. Были проведены одноэтапная ферментация с пополнением только проточной средой и двухэтапная ферментация с пополнением 0,1 г/дл этанола в массовой концентрации. Первое пополнение начинали, когда остаточный сахар в ферментационном бульоне составлял менее 5,0 г/л [1]. Второе добавление этанола проводили при уровне остаточного сахара менее 2,0 г/л. Второе добавление этанола проводили при уровне остаточного сахара менее 2,0 г/л. Второе добавление этанола проводили, когда уровень остаточного сахара в ферментационном бульоне был ниже 2,0 г/л. Результаты показаны на рисунке 4.

 

мг/мл и 21,34 мкг/мл, соответственно, после добавления этанола. 34 мкг/мл，加入乙醇后分别为 28 . Биомасса и общее количество каротиноидов составили 28,48 мг/мл и 21,34 мкг/мл без этанола, 28,3 мг/мл и 25,5 мкг/мл с этанолом. При добавлении 5 мкг/мл общее количество каротиноидов увеличилось в 1,2 раза по сравнению с таковым без этанола. После добавления этанола общее количество каротиноидов увеличилось в 1,2 раза по сравнению с таковым до добавления этанола, а качественная фракция каротиноидов увеличилась с 750 мкг/г до добавления этанола до 900 мкг/г, что составило 1,2 раза. Видно, что добавление этанола оказывает определенное влияние на накопление пигментов в WSS-FF6, но это увеличение меньше, чем в зарубежных исследованиях. Всего было добавлено 510 мл проточной среды, что эквивалентно начальной концентрации глюкозы 59 г/л в порционной ферментации. На основе биомассы и общего количества каротиноидов в двух порционных ферментациях в течение 130 ч были рассчитаны скорость роста дрожжей (ΔX/ΔS), скорость образования продукта (ΔP/ΔS) и массовая доля каротиноидов (ΔP/ΔS), которые составили 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46, 0,46 и 0,46 соответственно. 46, 0 . 0,46, 0,44 и 0,95 соответственно. Эффективность ΔX/ΔS, выход продукта ΔP/ΔS и массовая доля каротиноидов ΔP/ΔS составили 0,46, 0,44 и 0,95, соответственно, что совпадает с эффективностью периодической ферментации при массовой концентрации 40 г/л (табл. 2).

 

3 ВЫВОДЫ

Пакетное процеживание может улучшить рост и выход продукта штамма WSS-FF6, а добавление этанола во время процеживания может способствовать накоплению пигментов.

 

Ссылки:

[1] YAMANE Y, HIGASHIDA K, NAKASHIMADA Y, et al .  Влияние кислорода и глюкозы на первичный метаболизм и выделение астаксантина культурами phaffia rhodozymain периодического и кормового действия: кинетический и стехиометрический анализ[J].  Applied and Envir Microbiology, 1997, 63(1):4471 - 4478 .

[2] XU Xue-Ming, JIN Zheng-Yu, LIU Dang-Hui, et al. Процесс производства астаксантина дрожжами Фифа в бутылке с встряхивателем［J］. Журнал Усинского университета легкой промышленности, 2000, 19(3): 230 - 235 . [3] XU Xue-Ming, JIN Zheng-Yu, LU Yu-Hua. Селекция и разведение высокопродуктивного мутантного штамма астаксантина［J］. Пищевая и ферментационная промышленность, 2000, 26(5):22 - 27 .

[4] JAMES S J, DEEpTHI K, Экстракция и количественное определение астаксантина из phaffia rhodozyma [J].  Biotechnology Technoque, 1990, 4.

(2): 107 - 112 .

[5] Чжугэ Цзянь, Ван Чжэнсян. Руководство по экспериментальной технологии промышленной микробиологии [М]. Пекин: Издательство легкой промышленности Китая, 1994 .

[6] HO K p, TAM C Y, ZHOU B .  Рост и производство каротиноидов фафии родозимы в культурах периодического действия с различными методами кормления [J].  Biotechnol Letters, 1999, 21:175 - 178 .

[7] MEYER p S, Du pREEZ J C .  Влияние условий культивирования на производство астаксантина мутантом phaffia rhodozylma в периодической и хемостатной культуре［J］.  Appl Microbiol Biotechnol, 1994, 40:780 - 785 .

[8] AN G H, SCHUMAN D B, JOHNSON E A .  Выделение мутантов Pha『ia rhodozyma с повышенным содержанием астаксантина［J］.  Appl Envi- ron Microbiol, 1989, 55:116 - 124 .

[9] YAMANE Y, HIGASHIDA K, NAKASHIMADA Y, et al .  Производство астаксантина из фафии родозимы улучшено в культуре периодического действия с подачей глюкозы и этанола［J］.  Biotechnol Letters, 1997, 19(11):1109 - 1111 .

［10］GU W L, AN G H, JOHNSON E A, Этанол увеличивает производство каротиноидов в phaffia rhodozyma［J］.  J Ind Microbiol Biotechnol, 1997, 19(2):114 - 117 .