Каким образом красноволосые дрожжи производят астаксантин при брожении с желтой суспензией?

Аннотация: Исследован динамический процесс производства астаксантина при красной ферментации Saccharomyces cerevisiae с использованием желтой суспензионной воды. Результаты показали, что: биомасса достигла максимального значения 5,84 г/л примерно через 16 ч ферментации; производство астаксантина достигло максимального значения 2,43 мг/л через 60-72 ч ферментации; а содержание астаксантина достигло максимального значения 512 мкг/г высушенных бактериальных тел. При сравнении ферментации в желтой суспензионной воде с ферментацией в синтетической среде было обнаружено, что биомасса и продукция астаксантина, полученные при культивировании S. rosenbergii в желтой суспензионной воде, были в 1,85 и 1,30 раза выше, чем в синтетической среде, а содержание астаксантина в сухих клетках составляло 71% от такового в синтетической среде.

В результате ферментации фафии родозимы можно получить более 10 каротиноидов, из которых астаксантин составляет 60-85 %. Астаксантин - это натуральный красный пигмент, обладающий такими биологическими функциями, как антиоксидантная, противораковая, повышающая иммунитет и светочувствительность, который может широко использоваться в кормовой, пищевой, медицинской и косметической промышленности. Дешевая культуральная среда является важным аспектом для достижения промышленного производства астаксантина. Лян Синьле[1] и другие обнаружили, что красные волосяные дрожжи могут ферментировать целлобиозу и способствовать синтезу астаксантина. При добавлении других подходящих питательных веществ гидролизат целлюлозы может быть использован S. rosenbergii для роста и синтеза астаксантина. Ван Хунтао[2] и другие пытались использовать картофельный крахмал и гидролизат кукурузной амилазы в качестве источника углерода, а также использовать кукурузный сироп вместо дрожжевой пасты для культивирования S. rosenbergii для синтеза астаксантина, что было аналогично использованию глюкозы в качестве источника углерода, но с более низкой стоимостью ферментации. За рубежом Рамирес[3] и др. использовали сок финика силана в качестве единственного источника углерода, и при концентрации редуцирующего сахара 22,5% выход астаксантина составил 6,17 мг/л, что в 2,5 раза выше, чем на среде YM. Домингес-Боканегра и др.[4] обнаружили, что использование кокосового молока в качестве единственного источника энергии позволило увеличить выход астаксантина S. rossii, что превосходило показатели среды YM. Результаты были лучше, чем на среде YM. Также изучался синтез астаксантина с использованием гидролизата эвкалипта[5], гидролизата злаков[6] и сока сахарного тростника[7] в качестве источников углерода.

 

При переработке соевых продуктов образуется большое количество желтой суспензионной воды, которая представляет собой высококонцентрированные сточные воды с высокой степенью биохимии. Исследователи провели большую работу по извлечению соевых изофлавонов, соевых олигосахаридов и других биологически активных веществ из желтой шламовой воды, а также разработали способ использования желтой шламовой воды для производства одноклеточного белка, витаминов, напитков, жирных кислот и другие рациональные способы применения [8-9].

В данной работе было проведено динамическое исследование ферментации и синтеза астаксантина красными ферментационными дрожжами с использованием желтой суспензионной воды тофу в качестве природной среды, а также сравнение процессов ферментации в желтой суспензионной воде и среде синтеза.

 

1 Материалы и методы

1.1 Штаммы

AS 2.1557: приобретен в Центре коллекции штаммов Института микробиологии Китайской академии наук. 1.2 Культуральная среда и условия

Питательная среда: глюкоза 10 г, сусло (10.Bx) 3 г, яичный белок 5 г, дрожжевая паста 3 г, агар 20 г, водопроводная вода до 1 л, PH 6,0.

Жидкая посевная среда (среда YM[10] ): глюкоза 10 г, сусло (10.Bx) 3 г, белки 5 г, дрожжевая паста 3 г, водопроводная вода до 1 л, PH 6,0.

Среда синтеза[10] (IFS): глюкоза 20 г, (NH4 )2SO4 5 г, KH2PO4 1 г, MgSO4 .H2O 0,5 г, cacl2 0,1 г, дрожжевая паста 1 г, водопроводная вода до 1 л, PH6,0.

Желтая бульонная вода (HJS): получена с завода по переработке готового к употреблению тофу, центрифугирована при 800g, надосадочная жидкость отрегулирована до pH 6,0.

Культура активации сланта: возьмите организмы, сохранившиеся на сланте, залейте средой сланта и инкубируйте при 22℃ в течение 4 дней.

Жидкая культура семян: возьмите 2 кольца активированных организмов, поместите их в треугольные колбы объемом 250 мл, содержащие 25 мл жидкой посевной среды, и инкубируйте при 22℃, 210 об/мин в течение 48 ч.

Ферментация в колбе-встряхивателе: 2 мл посевного раствора инокулировали в 250 мл треугольные колбы, содержащие 23 мл IFS или HJS, ферментировали при 22℃, 210 об/мин, и периодически отбирали пробы для измерения.

 

1.3 Методы измерения

Определение биомассы клеток: турбидиметрический метод[11] использовался для измерения абсорбции организмов при 500 нм и расчета сухого веса клеток.

Выделение и определение астаксантина: для определения абсорбции астаксантина при 480 нм использовали метод ДМСО [12], выход астаксантина на единицу объема ферментационного бульона и содержание астаксантина на единицу веса высушенных бактерий рассчитывали по следующей формуле.

Объемный выход астаксантина (мг/л) = (Va × A) / ( 0,215Vb )

Содержание астаксантина в стволовых клетках (мкг/г) = (Va × A) / ( 0,215 × G )

Где: Va - объем экстракционного раствора (мл).

A - значение OD480 нм; 0,215 - коэффициент экстинкции.

Vb - объем ферментационного бульона, использованного для анализа (мл); G - сухой вес клеток в Vb мл ферментационного бульона (г).

Определение общего количества сахаров и редуцирующих сахаров: метод DNS[13]. Определение общего растворимого азота: колориметрический метод с салициловой кислотой[14] .  Для определения аминокислот использовался колориметрический метод[14] .

Определение общей золы: метод озоления [14].

Определение ионов: атомно-абсорбционная спектрофотометрия [14]. Определение общего фосфора: колориметрический метод с использованием молибденового синего [15].

Определение рН: метод портативного рН-метра [14]. Растворимые твердые вещества: рефрактометрический метод [16].

 

2 Результаты и обсуждение

2.1 Анализ состава воды для желтой суспензии (см. прилагаемую таблицу)

Как видно из таблицы, вода с желтой пульпой содержит больше питательных веществ, обеспечивая энергетические и питательные факторы для роста и размножения микроорганизмов.

 

2.2 Динамика получения астаксантина при ферментации воды из желтой целлюлозы с рыжими волосяными дрожжами (см. рис. 1)

Как показано на рис. 1, ферментация проводилась во встряхиваемых колбах с желтой суспензионной водой, рост бактерий был быстрым от 0 ч до 16 ч, и биомасса достигла максимального значения 5,84 г/л примерно в 16 ч, а затем имела тенденцию к снижению от 16 ч до 48 ч, и изменение биомассы после 48 ч было незначительным. Производство астаксантина быстро увеличивалось с 0 ч до 16 ч, не менялось значительно с 16 ч до 24 ч, а затем быстро увеличивалось с 24 ч до максимального значения 2,43 мг/л с 60 ч до 72 ч. Макровыражение производства астаксантина показало, что ферментационный бульон имел светло-розовый цвет через 16 ч, затем постепенно углублялся, а после 48 ч стал темно-красного цвета. Сравнение производства астаксантина и роста клеток во время ферментации показало, что на ранней стадии ферментации (0ч~16ч) эти две тенденции совпадали, но после того, как биомасса достигла максимального значения через 16ч ферментации, наблюдалось явление вторичного синтеза астаксантина, что указывало на то, что синтез астаксантина не был синхронизирован с ростом клеток, и что клетки имели способность продолжать синтезировать астаксантин после окончания активного роста. Содержание клеточного астаксантина существенно не менялось с 12 до 24 часов, но увеличивалось после 24 часов и достигало максимального значения 512 мкг/г высушенных организмов с 60 до 72 часов, что в основном совпадало с изменением производства астаксантина. Редуцирующий сахар показал тенденцию к увеличению с 0 до 12 часов, и пиковое значение редуцирующего сахара составило 7,39 г/л в 12 часов, что может быть связано с тем, что бактерии могли производить фермент для гидролиза олигосахарида в воде желтой пульпы, и скорость производства редуцирующего сахара была выше, чем скорость его потребления. Редуцированный сахар быстро снижался с 12 до 16 часов, что было связано с активным ростом и метаболизмом клеток. После 16 ч ферментации снижение редуцирующих сахаров происходило медленно, а после 20 ч ферментации редуцирующие сахара практически не снижались. Величина PH существенно не менялась от 0 до 16 часов, но начала увеличиваться после 16 часов, что может быть связано с потреблением солей органических кислот в воде желтой целлюлозы в результате метаболизма бактерий[17-18] , или с производством щелочных веществ (аммиака или аминов и т.д.) в результате микробного декарбоксилирования аминокислот и белков, которые были близки к нейтральным соединениям в воде желтой целлюлозы[19] .

Известно, что раффлезия может производить астаксантин путем ферментации с водой из желтой пульпы, а период ферментации составляет 60ч~72ч.

 

2.3 Сравнение ферментации дрожжей красной фифы в двух средах, IFS и HJS.

2.3.1 Сравнение биомассы ферментов, полученных на двух средах (см. рис. 2).

Из рис. 2 видно, что характеристики роста S. rosenbergii на двух культуральных средах были совершенно разными. При использовании IFS максимальный рост составил 3,23 г/л примерно через 72 часа, в то время как при использовании HJS максимальный рост составил 5,98 г/л через 24 часа, и биомасса постепенно снижалась по мере увеличения времени инкубации. Биомасса HJS была значительно выше, чем у IFS, а максимальная биомасса HJS в 1,85 раза превышала биомассу IFS. Результаты показали, что скорость роста и биомасса организмов были быстрее и выше при использовании воды из желтой целлюлозы в качестве культуральной среды.

 

2.3.2 Сравнение выхода астаксантина при ферментации на двух средах (см. рис. 3).

Как показано на рис. 3, тенденции производства астаксантина при ферментации на двух средах были одинаковыми, но производство астаксантина на HJS было значительно выше, чем на IFS в одно и то же время ферментации. Наибольший выход астаксантина 2,23 мг/л при использовании HJS наблюдался примерно через 72 ч, а наибольший выход астаксантина 1,69 мг/л при использовании IFS - через 63 ч. Наибольший выход астаксантина при использовании HJS был в 1,30 раза выше, чем при использовании IFS, что еще раз доказывает, что вода желтой целлюлозы может быть дешевым сырьем для производства астаксантина и что она может быть использована для производства астаксантина с более высоким выходом, чем IFS.

 

2.3.3 Сравнение содержания астаксантина в ферментах с использованием двух сред (см. рис. 4).

Как показано на рис. 4, изменения содержания клеточного астаксантина в дрожжах Raffles при использовании двух сред были совершенно разными: содержание клеточного астаксантина в HJS увеличивалось с увеличением времени ферментации, а содержание клеточного астаксантина в IFS уменьшалось с увеличением времени ферментации. При одинаковом времени ферментации содержание астаксантина в HJS было значительно ниже, чем в IFS. Максимальное цитозольное содержание астаксантина в HJS (72 ч) составляло 71 % от максимального цитозольного содержания астаксантина в IFS (24 ч).

 

2.3.4 Сравнение изменений содержания редуцирующих сахаров при ферментации с использованием двух сред (см. рис. 5).

Из рис. 5 видно, что редуцирующий сахар HJS практически не изменился после 24 ч ферментации, а редуцирующий сахар при максимальном производстве астаксантина составил 2,97 г/л. Для IFS редуцирующий сахар был выше в 24 ч ферментации, затем быстро снижался с 24 до 48 ч ферментации, а затем оставался практически неизменным в 48 ч ферментации, а редуцирующий сахар при максимальном производстве астаксантина составил 0,59 г/л, что было значительно ниже, чем остаточный редуцирующий сахар HJS. Это может быть связано с наличием в желтой воде редуцирующих сахаров, которые не могут быть утилизированы красными дрожжами, или с тем, что среда желтой воды не способствует полной утилизации сахаров.

 

2.3.5 Сравнение изменений PH при ферментации с использованием двух различных сред (см. рис. 6)

Из рисунка 6 видно, что динамика рН двух культуральных сред была совершенно разной. Значение рН после 24 часов ферментации с IFS практически не изменилось и составляло около 2,4, в то время как значения рН воды с желтой суспензией через 24 и 48 часов ферментации составляли 7,48 и 7,89, соответственно, а значение рН воды с желтой суспензией с 63 до 87 часов ферментации практически не изменилось и составляло около 8,2.

 

3 Заключение

Желтая навозная вода, выбрасываемая при производстве сои, богата питательными веществами, что благоприятно для роста Saccharomyces cerevisiae и синтеза астаксантина. По сравнению с синтетической культуральной средой, использование воды из желтой жижи в качестве единственного источника энергии привело к сокращению цикла ферментации (62~72 часа), увеличению объема бактерий и производства астаксантина, но снижению содержания астаксантина в клетках. Более того, использование воды из желтой суспензии в качестве культурального субстрата позволяет снизить стоимость сырья для производства ферментации и реализовать ресурсное использование сточных вод, что заслуживает дальнейшего изучения.

 

Ссылки.

[1] LEUNG Hsin-Lok, SHAM Pui-Lin, HA Li-Ming. Синтез астаксантина из гидролизата ферментированной целлюлазы дрожжей Fife pLX-All[J]. Mycosystems, 2000 , 19 (4): 534-539.

[2] WANG Hongtao, XU Xueming, JIN Zhengyu.  Ферментация и синтез астаксантина из гидролизата крахмала дрожжами Фифа[J]. Индустрия напитков, 2003, 24 (10): 48-50.

[3] RAMIRE Z J,NUNEZ ML,VALDIVIA R. Увеличение производства астаксантина мутантом phafiarhodozyma, выращенным на финиковом соке из yuca filifera [J]. JInd Microbiol, 2000, 24: 187-190.

[4] DOMINGUE Z-BOCANEGRA A R, TORRES-MUNOZ J A. Гиперпродукция астаксантина фафиарходозимой (теперь X- anthophylomyces dendrorhous) с использованием сырого кокосового сырым кокосовым молоком в качестве единственного источника энергии [J]. ApplMicrobiolBiot, 2004, 66 : 249-252.I

[5] CRUZ J M, pAXAJO J C. Улучшенное производство астаксантина Xanthophylomyces dendrorhous, растущим на энксиматических древесных гидролизатах, содержащих глюкозу и целлобиозу [J]. Food chem, 1998, 63 (4) : 479-484.

[6] KESAvA S S, AN G H, KIM G H, et al. Промышленная среда для улучшенного производства каротиноидов из мутантного штамма phafiarhodozyma [J]. BioprocessEng, 1998, 19: 165-170.

[7] FLORENCIO J A, SOCCOL C R, FUR LANETTO L F, et al. A Factorial approach for a sugarcane juice-based low cost culture medium : increasing the astax anthin production by red yeast phafia rhodozyma [ J ]. производства красных дрожжей phafia rhodozyma [ J ].  Bioprocess Eng, 1998, 19: 161-164.

[8] Ли Рит, Ли Цзайгуй, Инь Лицзюнь. Переработка и использование сои [М]. Пекин: Издательство химической промышленности, 2003. 359-375.

[9] Dai Chuanchao, Yuan Zhilin, Wang Anqi. Производство арахидоновой кислоты и эйкозапентаеновой кислоты путем ферментации соевых сточных вод[J]. Китайские жиры и масла, 2004 , 29 (5): 31-33.

[10] yAMANE y , HIGASHI DA K, NA KASHIMADA y, et al. Influence of oxygen and glucose on primary metabolism and astabolism and astaxanthin productionby phafiarhodozymain batch and fed-batch cultures : kinetic and stoichiometric analysis [J]. ApplEnvironMicrob, 1997, 63 : 4471-4478.

[11] RAMIREZ J, GUTIERREZH, GSCHAEDLERA. Оптимизация производства астаксантина уphafiarhodozyma с помощью факториального дизайна и методологии поверхности отклика методологии [ J ].  I Biotechnol, 2001, 88 : 259-268.

[12] SEDMAK J J, WEERASINGHE D K, JOLLY S O. Экстракция и количественное определение астаксантина из фатиарходозимы [J].BiotechnolTech, 1990 , 4 (2): 107-112.

[13] Отделение биохимии, биологический факультет, Пекинский университет. Руководство по лабораторным работам по биохимии [М]. Пекин: Издательство высшего образования, 1984. 23-26.

[14] Даляньский институт легкой промышленности, Южно-Китайский технологический университет, Чжэнчжоуский институт легкой промышленности. Анализ пищевых продуктов [М]. Пекин: Издательство легкой промышленности Китая, 1996.

[15] Luo P. Анализ и тестирование напитков [М].  Пекин: Издательство легкой промышленности Китая, 1992.481-482.

[16] Тяньцзиньский институт легкой промышленности, Даляньский институт легкой промышленности, Усинский институт легкой промышленности и др. Промышленная ферментация и анализ ферментации [М].  Пекин: Издательство легкой промышленности Китая, 1991.147.

[17] Li Yuexiu, Wang Huichuan. Очистка и комплексная утилизация сточных вод с завода по производству продуктов из соевых бобов[J]. Журнал Юньнаньского нормального университета, 1999, 19 (3): 40-42.

[18] FLORES-COTERA L B, MARTIN R, SANCHEZ S. Citrate, a possible precursor of astaxan'thin in .phafia rhodozyma influence of varying Влияние различных уровней фосфата аммония и цитрата в химически определенной среде [ J ].  ApplMicrobiolBiot , 2001, 55 : 341-347.

[19] Усинский институт легкой промышленности, Южно-Китайский инженерный институт, Тяньцзиньский институт легкой промышленности и др. Микробиология [М]. Пекин: Издательство легкой промышленности, 1980.284-285.