Оценка различий в антиоксидантной способности астаксантина из разных источников на основе клеток Hep G2

 Астаксантин (3,3 /-дигидрокси-4,4 /-дикето-β,β /-каротин) - это вид каротиноида, образующегося при окислении β-каротина, который широко распространен в водорослях, грибах, креветках, крабах и рыбах и существует в основном в виде стереоизомеров, геометрических изомеров, свободных или этерифицированных форм[1] . Chlorella pyrenoidosa - зеленая микроводоросль с самым высоким содержанием астаксантина в природе. Суммарное содержание астаксантина в Chlorella pyrenoidosa составляет около 30 г/кг сухих клеток, которая является одним из основных источников природного астаксантина [2]. Синтетический астаксантин (S-AST) производится химическим и синтетическим путем и сильно отличается от природного астаксантина, содержащегося в Chlorella vulgaris. 

Во-первых, эфирный стаксантин Haematococcus pluvialis (E-AST) существует в основном в этерифицированной форме, тогда как S-AST находится в свободном состоянии; во-вторых, E-AST существует в основном в структуре 3S,3S/, тогда как соотношение (3S,3′S) : (3R,3′R) : (3S,3′R) в S-AST составляет 3S,3′R, и соотношение (3S,3′R) : (3R,3′R) в S-AST составляет 3S,3′R. 3′R) : (3S , 3′R) : (3S , 3′R) в S-AST составляет примерно 1 : 2 : 1 [3].

 В ходе нормальных метаболических реакций организмы генерируют высокореактивные виды кислорода (ROS), такие как OH, O2 и H2 O2, а накопление избыточного количества свободных радикалов и ROS может привести к окислительному повреждению[4] . Астаксантин является поглотителем свободных радикалов, антиоксидантом, разрушающим цепи, и тушителем ROS и реактивного азота[5] . Было установлено, что астаксантин является каротиноидом, образующимся при окислении β-каротина, и широко распространен в водорослях, грибах, креветках, крабах и рыбе, в основном в стереоизомерной, геометрической изомерной, свободной или этерифицированной формах[1] . Раффлезия - вид зеленых микроводорослей, отличается самым высоким содержанием астаксантина в природе, суммарное содержание астаксантина в раффлезии 2 составляет около 30 г/кг сухих клеток, является одним из основных источников природного астаксантина [2]. Синтетический астаксантин (S-AST) производится химическим и синтетическим путем и сильно отличается от природного астаксантина, содержащегося в Rhodococcus aureus. Во-первых, эфирный астаксантин Haematococcus pluvialis (E-AST) существует в основном в этерифицированной форме, в то время как S-AST находится в свободном состоянии; во-вторых, E-AST существует в основном в структуре 3S,3S/, в то время как S-AST имеет (3S,3′S) : (3R,3′R) : (3S,3′R). Соотношение (3S,3′S) : (3R,3′R) : (3S,3′R) : (3S,3′R) в S-AST составляет примерно 1 : 2 : 1 [3].

В ходе нормальных метаболических реакций организмы генерируют высокореактивные виды кислорода (ROS), такие как OH, O2 и H2 O2, а накопление избыточного количества свободных радикалов и ROS может привести к окислительному повреждению[4] . Астаксантин является поглотителем свободных радикалов, антиоксидантом, разрушающим цепи, и тушителем ROS и реактивного азота[5] . Было установлено, что астаксантин может

 

 

Астаксантин подавлял индуцированную Helicobacter pylori продукцию ROS в митохондриях человеческих желудочных эпителиальных клеток AGS и может быть связан с повышением уровня внутриклеточных антиоксидантных ферментов[6] . Высокая температура (41 ℃) вызывала снижение активности бычьих ооцитов, увеличение внутриклеточного содержания ROS и вводила клетки в состояние теплового шока, в то время как астаксантин мог защитить клетки путем удаления ROS и восстановить активность бычьих ооцитов[7] . Сопряженная полиеновая структура астаксантина позволяет ему легче соединяться со свободными электронами, что значительно увеличивает количество электронов свободных радикалов, которые могут быть погашены астаксантином, поэтому астаксантин обладает более высокой антиоксидантной активностью по сравнению с обычными антиоксидантами, такими как β-каротин, лютеин и витамин Е[3] . Стоит отметить, что существуют различия в антиоксидантной активности астаксантина из разных источников. Анализы in vitro показали, что E-AST превосходит S-AST по способности гасить моноокислительные радикалы и сжигать свободные радикалы, а антиоксидантная активность E-AST примерно в 14 раз сильнее, чем у S-AST, в то время как S-AST сильнее сжигает пероксинитрит и - OH[3] .

 

Митохондрии являются энергетическим центром клетки и основным источником внутриклеточных ROS[8] . Флуоресцентные зонды играют важную роль в обнаружении ROS как высокочувствительный анализ. DCFH-DA является общим флуоресцентным зондом для обнаружения общего ROS (- OH, H2 O2, RO2 -) в клеточных митохондриях и цитоплазме, DHR123 может обнаружить H2 O2 и HClO в клеточных митохондриях, а DHE является специфическим зондом для обнаружения -O2 -[9]. DHE является специфическим зондом для обнаружения O2[9] . DCFH-DA, DHR123 и DHE использовались для изучения влияния лобелии на уровень ROS в клетках HepG2, и было обнаружено, что лобелия индуцирует увеличение - OH и H2 O2 в цитоплазме и митохондриях клеток HepG2, но не оказывает значительного влияния на митохондриальный - O2 - [10]. В ряде исследований было показано, что астаксантин может проявлять свою антиоксидантную способность, сжигая внутриклеточные ROS с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA[11-12], однако лишь немногие работы сообщали о влиянии различных источников астаксантина на содержание внутриклеточных молекул ROS с помощью различных специфических флуоресцентных зондов.

Клетки HepG2 являются идеальной клеточной моделью для анализа антиоксидантной активности натуральных активных продуктов благодаря их высокой пролиферативной способности и легкой доступности. Поэтому в данном исследовании клетки HepG2 были использованы в качестве модели, а три вида специфических флуоресцентных зондов были использованы для обнаружения изменений внутриклеточного содержания ROS после обработки двумя различными источниками астаксантина и для сравнения различий внутриклеточной антиоксидантной способности двух различных источников астаксантина по клеточной антиоксидантной активности (CAA), с целью обеспечения теоретической основы для дальнейшего развития и рационального использования астаксантина. Мы также сравнили различия во внутриклеточной антиоксидантной активности астаксантина из двух разных источников по CAA, чтобы обеспечить теоретическую основу для дальнейшего развития и рационального использования астаксантина.

 

1 Материалы и методы

1.1 Материалы

1 . 1 . 1 Экспериментальные объекты

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 (№ SCSP-510) были приобретены в Банке стволовых клеток Китайской академии наук и технологий.

 

1 . 1 . 2 Реактивы

E-AST (чистота: 50%), Yunnan Aerogen Biotechnology Co., Ltd; S-AST, Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd; среда MEM, фетальная бычья сыворотка, стерильный равновесный солевой раствор D-Hank/s, Thermo Fisher Scientific (China) Co. Зонд: дихлордигидрофлуоресцеин-F ациловый эфир кислоты [2-(3,6-диаце-токси-2,7-дихлор-9 h-ксантен-9-ил ) бензойной кислоты, DCFH-DA ], дигидрородамин (DHR123), дигидрофридин (DHFH-DA), дигидроэтидиум (DHFH-DA) и DHR123 (DHR124). Дигидроэтидий (DHE), Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd; 2,2-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид [2 , 2 /-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид, ABAP], Sinopharm Group Chemical & Reagent Co. Ltd.

 

1 . 1 . 3 Основные инструменты

CO2-инкубатор, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd; инвертированный микроскоп, McAuldie Industrial Group Co., Ltd; многофункциональный маркиратор ферментов Syn-ergy2, Berten Instruments Co.

 

1.2 Методология

1 . 2 . 1 Выживание клеток HepG2 методом МТТ

Клетки HepG2 в логарифмической фазе роста были инокулированы в 96-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 1 × 104 клеток/мл и помещены в 37 ℃, 5% CO2 инкубатор на 24 ч. После предварительного культивирования среда в лунках была аспирирована и добавлено 100 мкл бессывороточной культуральной среды, содержащей 0, 2, 5, 5, 10 мкмоль/л астаксантина из различных источников, и контрольная группа и холостая группа были созданы в четырех репликах каждая. После 24 ч предварительной культуры в инкубаторе при 37 ℃ и 5% CO2 добавьте 100 мкл бессывороточной культуральной среды, содержащей 0, 2,5, 5, 10 мкмоль/л астаксантина из разных источников, и одновременно создайте контрольную и холостую группы, по 4 реплики в каждой группе. После 24 ч обработки двумя астаксантинами добавьте 10 мкл раствора МТТ в каждую лунку и продолжайте инкубировать в течение 4 ч. Удалите супернатант, добавьте 100 мкл раствора формазана во все лунки, хорошо перемешайте и верните в инкубатор для клеточной культуры на 4 ч, пока астаксантин не будет виден в инвертированном микроскопе. Инкубируйте в клеточном инкубаторе еще около 4 ч, пока в инвертированном микроскопе не будут видны фиолетовые кристаллы. Поглощаемость каждой лунки при 570 нм измеряли с помощью ферментного маркера и рассчитывали влияние различных концентраций астаксантина из разных источников на выживаемость клеток HepG2.

 

1 . 2 . 2 Измерение внутриклеточного содержания ROS

Клетки HepG2 инокулировали при плотности 1 × 104 клеток/мл в стерильные, полностью черные 96-луночные планшеты, и когда рост клеток достигал 80%, добавляли 100 мкл бессывороточной культуральной среды, содержащей 0, 2,5, 5 и 10 мкмоль/л астаксантина из разных источников. После 24 ч обработки двумя видами астаксантина старый культуральный раствор отбрасывали, добавляли 100 мкл 10 мкмоль/л флуоресцентного зонда и инкубировали в инкубаторе в течение определенного времени (время инкубации для флуоресцентных зондов DCFH-DA, DHR123 и DHE составляло 20, 30 и 40 мин, соответственно). После инкубации зонды промывали 1~2 раза PBS, чтобы удалить зонды, не попавшие в клетки. Наконец, в каждую лунку добавляли 100 мкл PBS и измеряли интенсивность флуоресценции с помощью флуоресцентного ферментного маркера в условиях отсутствия света. Длины волн возбуждения и эмиссии трех флуоресцентных зондов составляли DCFH-DA:495 нм/529 нм, DHR123:507 нм/529 нм и DHE:518 нм/605 нм, соответственно. Затем рассчитывали уровни РОС в клетках HepG2 после обработки двумя различными источниками астаксантина, как показано в уравнении (2).

Относительная интенсивность флуоресценции/% = -- × 100 (2) где: F реальная, F пустая, F пара представляет собой интенсивность флуоресценции экспериментальной группы, пустой группы и контрольной группы, соответственно.

 

1 . 2 . 3 Определение стоимости CAA

Клетки HepG2 были взяты из логарифмической фазы роста, плотность клеток была доведена до 6 × 104 клеток/мл и инокулирована в стерильные полностью черные 96-луночные планшеты. В соответствии с экспериментальным методом WOLFE et al [13], в конце культивирования клеток старую среду удаляли из лунок, а клетки промывали стерильным раствором D-Hank's 1~2 раза, чтобы отмыть клетки с неполной адгезией стенок и мертвые клетки. В экспериментальную группу добавляли 100 мкл бессывороточной культуральной среды, содержащей астаксантин и зонд DCFH-DA (25 мкмоль/л) из разных источников в разных концентрациях (0, 2,5, 5, 10 мкмоль/л), а в контрольную и холостую группы - 100 мкл бессывороточной культуральной среды, разбавленной зондом DCFH-DA. Инкубируйте клетки в 5% CO2 инкубаторе при 37 ℃ в течение 1 ч. Промойте клетки стерильным раствором D-Hank's 2~3 раза, добавьте 100 мкл раствора ABAP (600 мкмоль/л) в экспериментальную и контрольную группы, и добавьте 100 мкл стерильного раствора D-Hank's в пустую группу, а затем поместите клетки в флуоресцентный ферментный маркер для чтения флуоресценции в реальном времени. Флуоресценцию в реальном времени измеряли с интервалом 5 мин в течение 1 ч. Длина волны возбуждения составляла 485 нм, длина волны эмиссии - 538 нм.

 

1.3 Обработка данных и статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартная ошибка, экспериментальные данные были статистически проанализированы с помощью SPSS 25.0. Для ANOVA и множественных сравнений экспериментальных результатов использовались метод Дункана и t-тест, соответственно, при этом P < 0,05 считалось значимым. P < 0,05 считалось значимым. Для построения графиков статистических результатов использовали программу GraphPad Prism 8.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние различных источников астаксантина на выживаемость клеток HepG2 Как показано на рис. 1, после 24 ч обработки различными источниками астаксантина клетки.

Выживаемость клеток превышала 85% в группе лечения 10 мкмоль/л E-AST, причем выживаемость клеток была значительно выше в группе лечения 10 мкмоль/л E-AST по сравнению с контрольной группой (P < 0,05), в то время как в остальных группах лечения не было значительной разницы по сравнению с контрольной группой (P > 0,05). Это указывает на то, что два различных источника астаксантина не оказывали значительного токсического побочного действия на клетки HepG2 при той концентрации астаксантина, которая использовалась в каждой группе лечения в данном эксперименте.

2. 2 Влияние различных источников астаксантина на количество внутриклеточных ROS 3 в клетках HepG25

Результаты DCFH-DA в клетках HepG2, обработанных различными концентрациями E-AST и S-AST в течение 24 ч, представлены на рис. 2-а. По сравнению с контрольной группой, содержание ROS в клетках HepG2 снижалось после обработки E-AST и имело тенденцию к снижению, затем к увеличению, а затем к уменьшению с увеличением концентрации E-AST, при этом содержание ROS в группах 2,5 и 10 мкмоль/л было значительно ниже, чем в контрольной группе (P < 0,05). Содержание внутриклеточной ROS в группах 2,5 и 10 мкмоль/л было значительно ниже, чем в контрольной группе (P < 0,05). Содержание внутриклеточной ROS в группах 2,5 и 10 мкмоль/л было значительно ниже, чем в контрольной группе (P < 0,05), а в группе 5 мкмоль/л содержание ROS было самым высоким, но все же ниже, чем в контрольной группе. 05); однако существенной разницы между группами, получавшими астаксантин в одинаковой концентрации из разных источников, не было (P > 0,05). Как показано на рис. 2-b, содержание внутриклеточного H2 O2 в клетках HepG2, обработанных различными концентрациями E-AST в течение 24 ч, было значительно снижено по сравнению с контрольной группой (P < 0,05), и самое низкое содержание внутриклеточного H2 O2 было обнаружено при концентрации 5 мкмоль/л. Содержание внутриклеточного H2 O2 в клетках HepG2, обработанных S-AST, было немного снижено, но только при концентрации 5 мкмоль/л. Содержание внутриклеточного H2 O2 в клетках HepG2, обработанных E-AST, было значительно снижено по сравнению с клетками HepG2, обработанными S-AST. Результаты DHE показали, что внутриклеточное содержание H2 O2 снижалось при добавлении двух различных источников астаксантина, но только при 2,5 мкмоль/л. Внутриклеточное содержание H2 O2 также снижалось при добавлении двух различных источников астаксантина, но только при 2,5 мкмоль/л. Внутриклеточное содержание H2 O2 также снижалось при добавлении двух различных источников астаксантина. Результаты DHE показали, что хотя содержание внутриклеточного -O2- снижалось при добавлении двух различных источников астаксантина, разница была значительной только при обработке 2,5 мкмоль/л S-AST по сравнению с контрольной группой (P < 0,05); между группами с одинаковой концентрацией различных источников астаксантина не было значительной разницы (P > 0,05) (Рисунок 2-c).

 

2. 3 Внутриклеточная антиоксидантная активность клеток HepG2 после обработки различными источниками астаксантина

Как показано на рис. 3, E-AST подавлял увеличение интенсивности флуоресценции, вызванное увеличением продукции DCF, дозозависимым образом (рис. 3-а), а способность S-AST ингибировать окисление была лучше, чем у групп 2,5 и 10 мкмоль/л (рис. 3-b) при концентрации 5 мкмоль/л. Концентрация S-AST в 5 мкмоль/л была лучше, чем в группах 2,5 мкмоль/л и 10 мкмоль/л (рис. 3-b).

Значения CAA значительно увеличивались после добавления астаксантина из разных источников и достоверно отличались при концентрации 10 мкмоль/л (P < 0,05), однако не было значительной разницы между астаксантином из разных источников при одинаковой концентрации (P > 0,05) (рис. 4). Однако существенной разницы между разными источниками астаксантина при одинаковой концентрации не было (P > 0,05) (рис. 4).

 

3. обсуждение и выводы

В данном исследовании три специфических флуоресцентных зонда (DCFH-DA, DHR123, DHE) были использованы для измерения содержания ROS в клетках HepG2, обработанных двумя различными источниками астаксантина в течение 24 ч. Результаты показали, что два различных источника астаксантина могут снизить содержание внутриклеточных ROS, не вызывая очевидных токсических побочных эффектов на клетки. Результаты показали, что астаксантин из двух разных источников может снижать содержание внутриклеточной ROS без явных токсических побочных эффектов на клетки. Было обнаружено, что астаксантин подавляет BPA-индуцированное содержание ROS в фибробластах нормальной кожи человека[14] . SUDHARSHAN et al.[12] обнаружили, что астаксантин может подавлять H2 O2-индуцированный окислительный стресс и повреждение ДНК в клетках дрожжей путем снижения содержания внутриклеточной ROS в клетке дрожжей с помощью зонда DCFH-DA. В клетках печени мыши, окрашенных флуоресцентным зондом DHE, астаксантин снижал содержание внутриклеточных ROS и ингибировал индуцированные ишемией/реперфузией апоптоз и аутофагию; MACEDO et al. [16] оценили влияние астаксантина на нейтрофилы путем измерения уровня внутриклеточного H2 O2 с помощью DHE и анализа на фенол-2, и обнаружили, что астаксантин снижает уровень внутриклеточного O2 и H2 O2, а влияние астаксантина на нейтрофильные клетки оценивалось с помощью DHE и анализа на фенол-2. Результаты показали, что астаксантин способен снижать уровни внутриклеточного O2 и H2 O2, а также повреждение липидов и белков, что было сходно с результатами настоящего исследования. Следует отметить, что результаты DHR123 показали, что способность астаксантина из разных источников к поглощению H2 O2 различалась, и содержание H2 O2 в внутриклеточной среде в группе, обработанной E-AST, было значительно ниже, чем в группе, обработанной S-AST, при обработке 5 мкмоль/л астаксантина. Наконец, сравнивая результаты различных зондов, было обнаружено, что E-AST обладал более сильной способностью к поглощению H2 O2 (53,47%) при 5 мкмоль/л, тогда как S-AST обладал более высокой способностью к поглощению H2 O2 (53,47%). 47%), в то время как S-AST обладал более высокой способностью к поглощению внутриклеточных ROS (62,96%). 96% ). Приведенные выше результаты свидетельствуют о различиях в способности астаксантина к поглощению ROS между двумя разными источниками.

 

Метод CAA был разработан WOLFE et al [13] для количественной оценки антиоксидантной активности растений, пищевых экстрактов и диетических добавок. RCHUGNIER et al [17] использовали метод CAA для сравнения внутриклеточной антиоксидантной способности натурального экстракта астаксантина и S-AST и обнаружили, что значение CAA E-AST было выше, чем S-AST в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs). Было обнаружено, что значение CAA E-AST было выше, чем S-AST в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs). YANG et al. [18] сравнили внутриклеточную антиоксидантную способность различных стереоконформаций астаксантина (полностью трансастаксантина, 13Z-астаксантина и 9Z-астаксантина) на модели совместной культуры клеток Caco-2/HT-29 с помощью метода CAA и обнаружили, что внутриклеточная антиоксидантная способность 13Z-астаксантина была выше, чем у полностью трансастаксантина и 9Z-астаксантина, а самая низкая внутриклеточная антиоксидантная способность была обнаружена у 9Z-астаксантина, что может быть связано с клеточной реакцией на полностью трансастаксантин и 9Z-астаксантин. Наименьшая внутриклеточная антиоксидантная способность была обнаружена у 9Z-астаксантина, что может быть связано с различиями в эффективности накопления неконфигурированного астаксантина в клетках. Приведенные выше исследования позволяют предположить, что внутриклеточная антиоксидантная способность астаксантина тесно связана с его источником, конформацией или формой. В настоящем исследовании, чем выше концентрация E-AST, тем ниже значение флуоресценции, что говорит о его способности сжигать внутриклеточные реактивные формы кислорода, в то время как S-AST обладает самой сильной способностью сжигать кислород при концентрации 5 мкмоль/л. Значения CAA двух различных источников астаксантина увеличивались с ростом концентрации астаксантина, но существенной разницы между двумя источниками астаксантина не было, что может быть связано с различными формами астаксантина или эффективностью накопления в клетках HepG2.

 

Исследования показали, что астаксантин по-разному влияет на содержание ROS, уровень GSH и сигнальный путь Nrf2-ARE в клетках HepG2, PC12, U937 и Huh7, что говорит о различиях в антиоксидантном действии астаксантина на разные клетки[19] . В HUVECs E-AST активировал сигнальный путь Nrf2, индуцируя следовое производство ROS, но S-AST не влиял на экспрессию мРНК целевых генов Nrf2 в клетках Huh7[20 -21] . Результаты настоящего исследования также позволяют предположить, что антиоксидантная способность двух различных источников астаксантина неодинакова и может быть связана с различной способностью двух астаксантинов к поглощению внутриклеточных ROS. Поэтому необходимо сравнить антиоксидантную способность астаксантина из разных источников, конформаций и форм, а также проанализировать конкретные механизмы их действия в экспериментах in vitro и in vitro.

 

Ссылки:

[1] HIGUERA-CIAPARA I , FCHULLIX-VALENZUELA L , GOYCOOLEA F M. Astaxanthin: A review of its chemistry and applications[ J] .  Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2006, 46 (2) : 185 - 196 .

[2] AMBATI R R , PHANG S M , RAVI S , et al. Astaxanthin: Sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applica- tions: A review [2] AMBATI R R , PHANG S M , RAVI S , et al. J] . Marine Drugs, 2014, 12(1) :128 - 152 .

[3] CAPELLI B , TALBOTT S , DING L. Источники астаксантина: пригодность для здоровья и питания человека[J] . Functional Foods in Health and Disease, 2019 , 9(6) :430 -445 .

[4] SIES H , JONES D P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents[ J] . Nature Reviews Molecular Cell Biology , 2020 , 21(7) :363 -383 .

[5] FASSETT R G , COOMBES J S. Astaxanthin: A potential therapeutic agent in cardiovascular disease[ J] . Marine Drugs, 2011, 9 (3) : 447 -465 .

[6] KIM S H , LIM J W , KIM H. Астаксантин предотвращает снижение уровня су- пероксиддисмутазы 2 и активности супероксиддисмутазы в Heli- cobacter pylori- инфицированных эпителиальных клеток желудка[J] . Journal of Cancer Prevention , 2019 , 24(1) :54 -58 .

[7] ISPADA J , RODRIGUES T A , RISOLIA P H B , et al. Astaxanthin counteracts the effects of heat shock on maturation of bovine oocytes[ J] .  Reproduction , Fertility , and Development , 2018 , 30(9) :1169 - 1179 .

[8] KIM S H , KIM H. Inhibitory effect of astaxanthin on oxidative stress- induced mitochondrial dysfunction-a mini-review [ J ] .  Nutrients , 2018 , 10(9) :1137 .

[9] LIU J L , DU C M. Обнаружение реактивного кислорода с помощью флуоресцентных зондов: прогресс в исследованиях[J] . Chinese Agricultural Science Bulle- tin , 2018 , 34(33) :160 - 164 .

[10] MENG X Q , ZHANG W , ZHANG F , et al. Solanine-induced reac- tive oxygen species inhibit growth of human hepatocellular carci- noma HepG2 cells[J] . Oncology Letters, 2016, 11 (3) : 2145 - 2151.

[11] HU Y Y , SHEN L , LI L , et al. Астаксантин защищает от диа- бетической кардиомиопатии через активацию Akt-пути в клетках H9c2 [J] . Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2018 , 17(11) : 2151 -2156 .

[12] SUDHARSHAN S J , DYAVAIAH M. Astaxanthin protects oxidative stress mediated DNA damage and enhancing longevity in Saccharomy- ces cerevisiae [J] . Biogerontology , 2021 , 22(1) :81 - 100.

[13] WOLFE K L , LIU R H. Анализ клеточной антиоксидантной активности (CAA) для оценки антиоксидантов, продуктов питания и диетических добавок [ J] .  Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии, 2007, 55 (22) : 8896 -8907 .

[14] LIM S R , KIM D W , SUNG J , et al. Astaxanthin inhibits autoph- agic cell death induced by bisphenol A in human dermal fibroblasts [J] . Antioxidants (Basel, Switzerland), 2021, 10(8) :1273 .

[15] LI J J, WANG F, XIA Y J, et al. Предварительная обработка астаксантином ослабляет апоптоз и аутофагию, вызванные ишемией печени и реперфузией, через ROS/MAPK. через ROS/MAPK путь у мышей[J] . Marine Drugs , 2015 , 13(6) :3368 -3387 .

[16] MACEDO R C , BOLIN A P , MARIN D P , et al. Прием астаксантина улучшает функцию нейтрофилов человека: исследование in vitro [J] . Eu- ropean Journal of Nutrition, 2010, 49(8) :447 -457 .

[17] RCHUGNIER P , BASTIAS J , RODRIGUEZ-RUIZ V , et al. Astaxan- thin из Haematococcus pluvialis предотвращает окислительный стресс на эндотелиальных клетках человека. без токсичности[J] . Marine Drugs , 2015 , 13(5) :2857 -2874 .

[18] YANG C , ZHANG L F , ZHANG H , et al. Быстрое и эффективное преобразование всего Е-астаксантина в 9Z- и 13Z-изомеры и оценка их стабильности и антиоксидантной активности[J] . Journal of Agri- cultural and Food Chemistry , 2017 , 65(4) :818 -826 .

[19] VISIOLI F , ARTARIA C. Astaxanthin in cardiovascular health and disease: Mechanisms of action, therapeutic merits, and knowledge gaps [J] . Food & Function, 2017, 8(1) :39 -63 .

[20] DOSE J , MATSUGO S , YOKOKAWA H , et al. Free radical scav- enging and cellular antioxidant properties of astaxanthin [J] . Inter- national Journal of Molecular Sciences, 2016 , 17(1) :103 .

[21] NIU T T , XUAN R R , JIANG L G , et al. Астаксантин индуцирует антиоксидантный путь Nrf2/HO-1 в клетках эндотелия пупочной вены человека путем генерирования следовых количеств ROS[J] . Journal of Agricul- tural and Food Chemistry , 2018 , 66(6) :1551 - 1559 .365 :130542 .

[20] WANG S J. Подготовка и поведение высвобождения масла семян пиона Mi- croencapsulation[D] . Наньчан:Наньчанский университет, 2017 .

[21] KARACA A C , NICKERSON M , LOW N H. Производство микрокапсул с использованием изолятов белка нута или чечевицы и мальтодекстрина Физико-химические Физико-химические свойства и окислительная защита инкапсулированного льняного масла[J] . Пищевая химия, 2013, 139(1 -4) :448 -457 .

[22] YADAV K , BAJAJ R K , MANDAL S , et al. Инкапсуляция фенольных веществ экстракта виноградных косточек с помощью концентрата сывороточного белка, мальто-декстрина и камеди арабики смеси[J] . Journal of Food Science and Technology, 2020, 57(2) :426 -434.