Влияние сильного света на синтез астаксантина Rhodococcus pyrenoidus sp.

 1 Введение

Haematococcus pluvialis, пресноводная зеленая водоросль, способна синтезировать и накапливать большое количество астаксантина, вторичного каротиноида с сильными антиоксидантными свойствами, при сильном световом облучении [1]. Однако механизм синтеза астаксантина под действием сильного света детально не изучен. 

Штайнбреннер [2] и др. предположили, что гены, кодирующие синтазу октагидро-ликопина и гидроксилазу каротиноидов, которые связаны с синтезом астаксантина, транскрибируются в большом количестве в клетках E. amurense [3] при сильном световом облучении. Однако этого оказалось недостаточно для выяснения механизма синтеза астаксантина, поскольку большой объем синтеза астаксантина, несомненно, был обусловлен экспрессией генов, кодирующих эти ферменты. Неясно, почему яркий свет стимулирует экспрессию этих генов.

Астаксантин является вторичным метаболитом, и его синтез должен быть тесно связан с внутриклеточным первичным метаболизмом с точки зрения системной биологии и метаболической инженерии. Поэтому в настоящем эксперименте было проведено исследование влияния света на первичный углеродный метаболизм (фотосинтез) и азотный метаболизм Rhodococcus aurantium, а также сравнение активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы и нитратредуктазы (NR), активности астаксантина и нитратредуктазы (NR) в клетках Rhodococcus aurantium при различной интенсивности света. Активность нитратредуктазы (NR), а также содержание астаксантина и концентрацию нитратов в культуральной среде анализируют и определяют механизм индуцированного сильным световым облучением синтеза астаксантина в Rhodococcus rainbowensis.

 

2 Материалы и методы

2.1 Виды водорослей и методы культивирования

Красные водоросли были приобретены в Институте водной биологии Китайской академии наук. Для определения влияния различной интенсивности света на синтез астаксантина водоросли собирали центрифугированием (12 000g, 5 мин) и дважды промывали деионизированной водой после предварительного культивирования в течение 5 дней при слабом освещении (50 мкмоль.фотон.м-2.с-1) и ресуспендировали в 500 мл конических колбах (50 мл) с модифицированной средой BBM (NaNO3 85 мг.L-1) и помещали в 500 мл коническую колбу (50 мл) с модифицированной средой BBM (NaNO3 85 мг.L-1). 85 мг.L-1) в конические колбы объемом 500 мл (50 мл) и помещают в шейкер с регулируемым освещением при слабом освещении 60 мкмоль.фотон.м-2.с-1 (LL) и среднем освещении 160 мкмоль.фотон.м-2.с-1 (LL). фотонов.м-2.с-1 (ML) и света высокой интенсивности 320 мкмоль.фотонов.м-2.с-1 (HL), соответственно, при температуре 25°C и скорости вращения 130 об.мин-1 . -1.

 

2.2 Методы анализа

Содержание астаксантина определяли тем же методом, что и в предыдущих экспериментах, см. литературу [3]. Активность рубиско и NR определяли по методам Квика [4] и Фишера [5], соответственно, и рассчитывали на основе влажного веса клеток (FW). Концентрацию NO3- определяли стандартным спектрофотометрическим методом [6].

 

3 Результаты и обсуждение

3.1 Биомасса

В условиях высокой освещенности (HL) биомасса Rhodococcus rainieri быстро росла в течение первых 3 дней (рис. 1), достигла максимума на 4-й день, а затем начала снижаться (с частичным распадом клеток). Биомасса ML имела схожую тенденцию, но все еще медленно росла через 4 дня. Напротив, биомасса LL практически не менялась в течение первых 3 дней, а на 4-й день вступила в экспоненциальный рост.

 

3.2 Астаксантин

Синтез астаксантина в R. rainbowii индуцировался как светом высокой, так и средней интенсивности. Синтез астаксантина впервые был индуцирован светом высокой интенсивности на 4-й день (рис. 2), а при свете средней интенсивности синтез астаксантина начался на 6-й день. К концу эксперимента содержание астаксантина достигло 3,9 и 1,1 мг.г-1 , соответственно, в отличие от LL, которая не накапливала астаксантин на протяжении всего эксперимента.

 

3.3 Активность рубиско

Активность рубиско в LL незначительно увеличивалась в 1-й день, а затем медленно снижалась (рис. 3). Напротив, активность Рубиско в HL и ML резко повышалась в 1-й день, увеличиваясь в 1,23 и 0,84 раза соответственно, оставалась относительно стабильной на 2-й день, а затем начала быстро снижаться. Снижение активности Рубиско в HL происходило быстрее, чем в ML, и составило 75,52% и 91,2% на 4-й день и в конце эксперимента, соответственно. В то же время активность Рубиско в ML снизилась на 48,22% и 83,1%, соответственно.

 

3.4 Деятельность NR

Динамика активности NR (рис. 4) в основном совпадала с динамикой активности Rubisco, т.е. активность NR в HL и ML резко увеличилась в 1,98 и 0,98 раза в первый день эксперимента, но затем начала быстро снижаться через 2 дня. На четвертый день они снизились до 28,5 и 48,0 % от максимальных значений, а затем еще более снизились до 4,7 и 19,4 % в конце эксперимента. В отличие от этого, активность NR в LL меньше изменялась в течение всего процесса инкубации и снизилась только на 29,8 % в конце эксперимента.

 

3,5 Концентрация нитратов

Концентрация нитратов в культуральном растворе имела тенденцию к снижению при различных интенсивностях света (рис. 5). В начале эксперимента концентрация нитратов в HL и ML быстро снижалась, а когда синтез астаксантина начался на четвертый (HL) и шестой (ML) день, концентрация NO3- в HL снизилась на 96,2%, а в ML - на 94,3%. Напротив, концентрация нитратов в LL снижалась медленно, на 56,8 % к концу эксперимента.

 

Для определения механизма синтеза астаксантина под действием сильного света результаты экспериментов были объединены и всесторонне проанализированы, и было установлено, что синтез астаксантина в клетках Rhodococcus aureus при различной интенсивности света протекал по сходной схеме, несмотря на различия во времени начала синтеза астаксантина и конечной продукции, т.е. синтез астаксантина начинался в клетках HL и ML только при снижении активности Rubisco и NR, а также концентрации нитрата до очень низкого уровня. В HL и ML синтез астаксантина начинался только тогда, когда активность Rubisco и NR и концентрация нитрата снижались до очень низкого уровня. С другой стороны, в LL, когда активность Rubisco и NR и концентрация нитрата поддерживались на высоком уровне, накопления астаксантина в клетках не происходило.

 

Свет прямо или косвенно влияет на активность Rubisco и NR, что в конечном итоге приводит к снижению их активности и концентрации нитратов: (1) В HL и ML увеличение интенсивности света стимулировало увеличение активности Rubisco и NR, причем чем выше интенсивность света, тем больше увеличивалась активность обоих. Это объясняется тем, что свет не только положительно регулирует активность Рубиско [7], но и положительно регулирует транскрипцию и экспрессию NR-кодирующих генов [8]. Таким образом, углеродный обмен и метаболизм Rhodococcus pyrenoidus тесно связаны и высоко интегрированы, и увеличение или уменьшение активности одного из ферментов, Rubisco и NR, приведет к увеличению или уменьшению активности другого фермента [9]. (2) Рубиско и NR являются ключевыми ферментами первичного метаболизма углерода (фотосинтеза) и метаболизма азота у R. rainbowii, и повышение их активности побудило R. rainbowii быстро поглощать нитрат для быстрого роста, и концентрация нитрата в культуральной среде быстро снизилась. Снижение концентрации нитрата, в свою очередь, привело к снижению активности Rubisco и NR. Этому есть две основные причины: во-первых, NR - индуцибельный фермент, и его активность положительно коррелирует с концентрацией нитрата, то есть чем выше концентрация нитрата, тем выше активность NR, и наоборот, чем выше, тем ниже активность. Во-вторых, как и другие белки, Rubisco и NR постоянно синтезируются и деградируют в процессе клеточного метаболизма с высокой текучестью [10]. Для синтеза Rubisco и NR необходим достаточный источник азота, поэтому значительное снижение концентрации нитрата приводило к недостаточному поступлению азота, что ингибировало синтез Rubisco и NR.

 

4 ВЫВОДЫ

На основании проведенного анализа было сделано предположение, что механизм синтеза астаксантина в R. rainbowii под действием сильного света заключается в том, что он повышает активность Rubisco и NR, что способствует быстрому росту клеток водоросли, приводя к быстрому снижению концентрации нитрата и в конечном итоге ингибированию активности этих двух ферментов, что приводит к снижению эффективности углеродного обмена R. rainbowii, т.е. к "углеродному голоданию". Углеродное голодание" (Carbon starvation). В этом состоянии активировались гены синтеза астаксантина, и клетки водоросли начали синтезировать большое количество астаксантина, чтобы выжить.

 

Ссылки:

[1] Boussiba S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: Cellular physiology and stress response [J].  Physiol Plantarum, 2000, 108: 111-117.

[2] Steinbrenner J, Linden H. Regulation of two carotenoid biosynthesis genes coding for phytoene synthase and carotenoid hydroxylase during stress- индуцированного астаксантина в зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [J]. Plant Physiol, 2001, 125: 810-817.

[3] Dong Q L, Zhao X M. Фиксация углекислого газа in situ в процессе производства природного астаксантина смешанной культурой Haematococcus pluvialis и Phaffia rhodozyma [J]. Catal Today, 2004, 98: 537-544.

[4] Quick W P, Schurr U, Fichtner K et al. Влияние уменьшения количества Рубиско на фотосинтез, рост, распределение и хранение в растениях табака, которые были трансформированных с помощью антисмысловых Rbcs [J]. Plant J, 1991, 1: 51-58.

[5] Fischer P, Klein U. Локализация азот-ассимилирующих ферментов в хлоропласте Chlamydomonas reinhardtii [J].  Plant Physiol, 1988, 88(188): 947-952.

[6] Clesceri L S, Greenberg A E. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater [M].  Вашингтон, округ Колумбия: Американская ассоциация общественного здравоохранения, 1989.

[7] Zhang N, Portis A R. Механизм световой регуляции Рубиско: специфическая роль более крупной изоформы активазы Рубиско, включающей восстановительную активацию тиоредоксином-f [J]. Proc Natl Acad Sci USA (Plant Biology), 1999, 96: 9438-9443.

[8] Quesada A, Fernandez E. Expression of nitrate assimilation related genes in Chlamydomonas reinhardtii [J]. Plant Mol Biol, 1994, 24: 185-194.

[9] Matt P, Krapp A, Haake V et al. Снижение активности Рубиско приводит к резким изменениям метаболизма нитратов, метаболизма аминокислот и уровней фенилпропаноидов и никотина в табачных антисмысловых трансформантах RBCS [J]. Plant J, 2002, 30(6): 663-677.

[10] Coruzzi G, Bush D R. Nitrogen and carbon nutrient and metabolitesignaling in plants [J]. Plant Physiol, 2001, 125: 61-64.