Извлечение и характеристика астаксантина из различных частей южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei)

 Южноамериканская белая креветка (Litopenaeus vannamei), научно известная как креветка Ванабина, относится к членистоногим филума Crustacea, Decapoda, Natantia, Penaeidae, Paneaus и подроду Litopenaeus[1-2] . Подрод Litopenaeus[1-2]. Южноамериканская белая креветка отличается быстрым темпом роста и длительным репродуктивным циклом, и вместе с китайской креветкой и пятнистыми креветками известна как самый высокий в мире объем производства трех основных видов культивируемых креветок, а также более крупный объем производства одного из видов культивируемых креветок.

Южноамериканская белая креветка обладает высокой питательной ценностью, содержит до 90 процентов белка в сухом виде и всего 1 процент жира, а также богата различными минеральными веществами[2-3] . Астаксантин (astaxanthin), молекулярная формула C40 H52 O4, химическое название 3,3'-дигидрокси-4,4'-дикето-β , β '-каротин, содержится во многих водных растениях. Каротин, присутствующий во многих водных животных[4] . Помимо сильных антиоксидантных свойств, астаксантин обладает антиканцерогенной и иммуноукрепляющей активностью[5] . Астаксантин природного происхождения можно получить из Rhodococcus pyrenoidus и дрожжей Файфа, а панцири и головы креветок, которые являются побочными продуктами переработки креветок, также содержат астаксантин[6] . Однако о распределении астаксантина в панцирях, головах и мясе креветок не сообщалось. Поэтому в данном исследовании сравнивалось влияние встряхивания на водяной бане и ультразвуковой экстракции на извлечение астаксантина из креветочной пасты, панцирей и мяса креветок, а также анализировалось относительное содержание свободного и эфирного астаксантина в экстрактах астаксантина с целью заложить основу для комплексного извлечения астаксантина из креветок, а также для последующего изучения активности астаксантина в белых южноамериканских креветках.

 

1 Материалы и методы

1.1 Основные материалы  

Белые креветки были приобретены в супермаркете China Resources Vanguard, район Динхай, город Чжоушань; безводный этанол был аналитически чистым и приобретен в Sinopharm; дихлорметан, метанол и ацетонитрил были хроматографически чистыми и приобретены в Shanghai Aladdin Biochemical Science and Technology Co.

 

1.2 Методы испытаний

1.2.1 Экстракция астаксантина

Замороженные южноамериканские белые креветки размораживались в проточной воде, панцири и паста креветок очищались вручную, панцири и паста креветок пропаривались в пароварке в течение 3 минут до покраснения, а мясо креветок пропаривалось в пароварке в течение 5 минут до покраснения мяса. Панцири и мясо креветок были разломаны по отдельности, а мясо креветок удалено.

2 г добавляли к 10 мл безводного этанола в соотношении 1:5 (m:V), панцири и мясо креветок экстрагировали встряхиванием на водяной бане (37 ℃, 1 ч) и ультразвуковой экстракцией (37 ℃, 1 ч), а креветочную пасту экстрагировали только встряхиванием на водяной бане (37 ℃, 1 ч). Смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин, а надосадочную жидкость разбавляли безводным этанолом до полного растворения.

15 мл, отстаивают. После 1 экстракции панцири креветок, креветочную пасту и остатки мяса креветок продолжают экстрагировать 2 раза при тех же условиях, надосадочную жидкость фиксируют до 15 мл и отставляют в сторону.

 

1.2.2 Определение общего содержания астаксантина

UV-Vis спектры креветочной пасты, креветочного панциря и мякоти креветок, экстрагированных встряхиванием на водяной бане и ультразвуком в течение одного раза, сканировались при 200-800 нм для определения характерных длин волн поглощения. Приготовьте 100 мкг/мл стандартного резервного раствора астаксантина путем определения 10 мг стандартного астаксантина в безводном этаноле в коричневой волюметрической колбе объемом 100 мл. Разбавьте стандартный резервный раствор безводным этанолом до 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 16,0, 32,0 мкг/мл раствора астаксантина, обнулите раствор безводным этанолом, а затем измерьте поглощение на характерной длине волны, чтобы построить стандартную кривую астаксантина.

 

1.2.3 Определение свободных и сложных астаксантинов

Для анализа содержания свободного и сложного астаксантина в панцирях и мясе креветок использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)[7]. Метод был следующим: Agilent 1260 HPLC, ZORBAX SB-C18, ZORBAX SB-C18 и ZORBAX SB-C18.

（Разделение проводилось на колонке 4,6 мм×250 мм (5 мкм) при 25 ℃ с объемом впрыска 10 мкл и скоростью потока 1 мл/мин. Разделение проводилось на 100% подвижной фазе A (дихлорметан ∶ метанол ∶ ацетонитрил ∶ вода = 5∶85∶5,5∶4,5) в течение 0~10 мин, и на 100% подвижной фазе B (дихлорметан ∶ метанол ∶ ацетонитрил ∶ вода = 22∶28∶45,5∶4,5) в течение 11~35 мин. 45.5 ∶ 4.5). Стандартный астаксантин (32 мкг/мл) элюировали в тех же условиях.

 

1.3 Статистический анализ данных  

Результаты выражали в виде среднего ± стандартное отклонение (n = 3) и сравнивали значимые различия между группами с помощью программы SPSS 19.0 (P<0,05). Для построения графиков использовалась программа Origin 2019.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние метода экстракции и количества экстракций на извлечение астаксантина из южноамериканской белой креветки Penaeus vannamei.

2.1.1 Результаты УФ-видимого спектрального сканирования. Астаксантин был извлечен из креветочной пасты, панциря креветки и мяса креветки с помощью встряхивания на водяной бане при 37 ℃ и ультразвука при 37 ℃ соответственно, а УФ-Vis спектры экстрактов показаны на рис. 1. Как показано на рис. 1, характерные пики поглощения экстрактов астаксантина из различных частей креветок были обнаружены при 477 нм, что соответствует результатам, полученным Ян Ся и др[8] . Кроме того, пики поглощения экстрактов астаксантина из разных частей креветки появлялись при 220 и 280 нм, которые были связаны с белками, пептидами или аминокислотами, предположительно из-за присутствия определенного количества воды в экстракционной системе (креветка сама по себе имеет высокое содержание воды), в результате чего одновременно экстрагировались водорастворимые или гидрофобные белки, пептиды или аминокислоты.

 

Рис.1 УФ-видимое сканирование экстрактов астаксантина из различных частей южноамериканской белой креветки Рис.1 УФ-видимое сканирование экстрактов асты из L. vannamei dif-.

разные части

 

2.1.2 Влияние методов экстракции на общее содержание астаксантина в панцирях, пасте и мясе креветок.

Как видно из рис. 2, стандартная кривая астаксантина имеет вид y = 0,097x + 0,010 8 (R2 = 0,992 6), что свидетельствует о хорошей линейной зависимости астаксантина в диапазоне 0 ~ 10 мкг/мл, и может быть использована для определения общего количества астаксантина в экстракте.

Рис.2 Стандартная кривая асты

Сравнение содержания астаксантина в креветочной пасте, панцире и мясе, экстрагированных встряхиванием на водяной бане и ультразвуком (рис. 3), показало, что наибольшее содержание астаксантина было обнаружено в креветочной пасте, экстрагированной встряхиванием на водяной бане (595,85 ± 53,21 мкг/г), затем в панцире креветки (168,64 ± 33,54 мкг/г), а наименьшее - в мясе креветки (49,82 ± 19,96 мкг/г). Ультразвук обладает хорошим эффектом разрушения стенок, однако содержание астаксантина в панцирях и мясе креветок, извлеченных ультразвуком, составило (157. 11 ± 17. 09) и (31.93 ± 6.27) мкг/г соответственно, что существенно не отличалось от такового при извлечении методом осцилляции на водяной бане (P>0.05).

 

Примечание: Разные строчные буквы указывают на значительные различия (P < 0,05)

Рис.3 Сравнение общего содержания асты, извлеченной различными

методы из различных частей L. vannamei

 

2.1.3 Влияние количества экстракций на содержание общего астаксантина в креветочной пасте, панцирях и мясе.

Далее было исследовано влияние встряхивания на водяной бане и ультразвуковой экстракции на извлечение астаксантина из креветочной пасты, панцирей и мяса, результаты представлены на рис. 4. Как видно из рис. 4, содержание астаксантина в креветочной пасте, экстрагированной встряхиванием на водяной бане три раза, составило (52,01 ± 16,41) мкг/г, что было значительно ниже, чем в креветочной пасте, экстрагированной один раз и два раза (P < 0,05). При встряхивании на водяной бане содержание астаксантина в панцирях креветок достигло (101,59 ± 3,52) мкг/г после одной экстракции, что было значительно выше, чем в панцирях креветок (44,12 ± 15,49 мкг/г) после двух экстракций (P < 0,05), тогда как астаксантин в мясе креветок был в основном полностью извлечен после одной экстракции. Под действием ультразвукового разрушения стенок не было обнаружено существенной разницы в содержании астаксантина в панцирях креветок после двух экстракций (P>0,05), а астаксантин в мясе креветок также был полностью извлечен после одной экстракции. Однако стоит отметить, что общее содержание астаксантина в панцирях креветок, экстрагированных ультразвуком (159,79 мкг/г), было ниже, чем в панцирях креветок, экстрагированных встряхиванием на водяной бане (179,10 мкг/г). Молекулы астаксантина имеют полиненасыщенную структуру и подвержены деградации под воздействием света, тепла и кислорода[5, 9] . Было обнаружено, что ультразвук разрушает весь транс-астаксантин до бесцветного неизвестного вещества, и эта деградация усиливается с увеличением мощности и времени ультразвука[9] . Снижение общего содержания астаксантина после ультразвуковой экстракции панцирей и мяса креветок на рис. 4 связано с деградацией части астаксантина под действием ультразвука.

 

2.2 Сравнение содержания свободного и эфирного астаксантина в различных частях южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei)  

Распределение свободного и сложного астаксантина в креветочной пасте, панцире и мясе, извлеченных методом встряхивания на водяной бане, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), результаты представлены на рис. 5. Из рис. 5 видно, что вблизи 8 мин наблюдается характерный пик поглощения стандарта астаксантина (свободного типа), и на основании квалификации времени элюирования можно сделать вывод, что свободный астаксантин содержится в креветочной пасте, панцире и мясе, извлеченных методом встряхивания на водяной бане. Гидроксильная группа на шестичленном кольце астаксантина может соединяться с жирными кислотами, образуя эфиры жирных кислот астаксантина[8, 10] . Эфиры астаксантина также имеют характерное поглощение в районе 477 нм, но поскольку они более гидрофобны, чем свободный астаксантин, время элюирования увеличивается, а время пика наступает позже. В соответствии с литературными данными[7], можно предположить, что пики продолжительностью 28-40 минут на рис. 5 должны представлять собой астаксантин эфирного типа. Интегрируя площади пиков, относительное содержание свободного и сложноэфирного астаксантина в креветочной пасте составило 38% и 62%, соответственно, а относительное содержание свободного и сложноэфирного астаксантина в креветочных панцирях было близко к относительному содержанию свободного астаксантина в креветочном мясе и достигало 60%. Видно, что наличие астаксантина в креветочной пасте, панцирях креветок и мясе креветок южноамериканской белой креветки в виде различных, свободных и эфирных астаксантинов в креветочной пасте, панцирях креветок и мясе креветок южноамериканской белой креветки в соотношении 2:3, 1:1 и 3:2, соответственно.

 

3 Заключение

Астаксантин из южноамериканских белых креветок имел типичный пик поглощения при 477 нм, а общее количество астаксантина, извлеченного при встряхивании на водяной бане, было выше, чем при ультразвуковой экстракции. Астаксантин свободного и эфирного типа был обнаружен в креветочной пасте, панцире и мясе, но в пасте преобладал астаксантин эфирного типа, в панцире астаксантин свободного и эфирного типа был близок друг к другу, а в мясе преобладал астаксантин свободного типа. Таким образом, в разных частях южноамериканской белой креветки состав астаксантина различен.

 

Ссылки:

[1] Wei Zhenna. Использование источников растительного белка Penaeus vannamei[D] . Чжаньцзян: Гуандунский океанический университет, 2010.

[2] Cai Shengli. Последние исследования и прогресс в аквакультуре креветок - Третий всемирный симпозиум по китайской аквакультуре креветок.

[3] CHEN Qin , CHEN Xiaohan , XIE Daxiang , et al. Содержание мякоти южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei), выращенной при различной солености, и ее мышечная масса.

[4] []Red. ,,Sub(ti:11. Исследование его свойств[D] . Пекин: Китайский сельскохозяйственный университет, 2006.

[5] HIGUERA-CIAPARA I , FÉLIX-VALENZUELA L , GOYCOOLEA F M. Astaxanthin: A review of its chemistry and applications [J] .Critical reviews

[6] io,siee, ,ntrnan iti,shrimp,4() в:1. процесс экстракции и стабильность

[J] . China Fisheries Quality and Standard ,2014 ,4(1) :43-52.астаксантин-эфир-продуцирующий штамм микроводоросли Haematococcus pluvialis[J] .Food chemistry ,2000 , 68(4) :443-448.

[8] YANG Xia, ZHANG Zhisheng, ZHENG Qianwei, et al. Оптимизация сверхкритической СО2-экстракции астаксантина из южноамериканской белой креветки Penaeus vannamei.