Как фосфолипиды влияют на осаждение астаксантина в японской болотной креветке Penaeus vannamei?

 Цвет тела ракообразных зависит от содержания в нем каротиноидов [ 1]. Однако из-за отсутствия соответствующих ферментов ракообразные не могут синтезировать каротиноиды с нуля, но они могут депонировать или преобразовывать каротиноиды из пищи непосредственно в свои собственные каротиноиды [2].

 

Астаксантин - важнейший каротиноид, влияющий на окраску тела ракообразных. Он связывается с белками, образуя голубые белки астаксантина, которые придают многим ракообразным темный зеленовато-голубой цвет тела. В условиях высокой температуры белки денатурируются, и астаксантин в хелате диссоциирует, проявляя свой собственный красный цвет [3]. Цвет тела является важным показателем товарного качества ракообразных.

В неволе малое количество эффективных источников цвета и нестабильный состав комбикормов привели к тому, что цвет тела ракообразных значительно ниже, чем у чистых природных диких видов [4]. Эти недостатки можно в определенной степени компенсировать, добавляя в комбикорма специальные эффективные источники цвета [5]. Однако астаксантин дорог, и затраты на добавление астаксантина составляют 10-20 % от стоимости кормовых ингредиентов [ 6], и увеличение скорости осаждения астаксантина в организме животного является потенциальным способом снижения затрат.

 

Будучи жирорастворимым пигментом, астаксантин нуждается в присутствии липидов для переваривания, всасывания и транспортировки. Фосфолипиды являются хорошими поверхностно-активными веществами благодаря своим полярным и неполярным амфифильным свойствам; они легко эмульгируются и обладают эффектом эмульгирования жиров [7]. Было показано, что добавление фосфолипидов может улучшить всасывание астаксантина в кишечнике и способствовать его депонированию в организме [8].

 

Астаксантин имеет длинную ненасыщенную сопряженную систему с нестабильными электронными орбиталями во внешнем слое и обладает высокой эффективностью в уничтожении свободных радикалов в клетках [9]. Способность астаксантина уничтожать свободные радикалы в 500 раз выше, чем у витамина Е. Когда астаксантин уничтожает реактивные радикалы кислорода in vivo, он восстанавливается до соответствующих кетонов и других продуктов восстановления. Поэтому факторы, вызывающие окислительный стресс, могут снижать отложение астаксантина. Фосфолипиды, с другой стороны, могут повышать активность антиоксидантных ферментов и тем самым снижать продукцию реактивных радикалов кислорода [10]. Таким образом, они могут оказывать синергетический эффект в антиоксидантном процессе, что может быть еще одним потенциальным способом, которым фосфолипиды способствуют осаждению астаксантина.

 

Японская болотная креветка (Macrobrachium nipponense), также известная как речная креветка, креветка, относящаяся к семейству Macrobrachium, болотная креветка, является важным видом в китайской аквакультуре, только в 2016 году объем производства достиг 272 600 т [11]. Цвет карапакса японской болотной креветки также является важной основой для оценки ее товарного качества. Поэтому настоящее исследование было проведено с целью изучения влияния фосфолипидов на осаждение астаксантина и их взаимодействия во время окислительного стресса, теоретического обоснования эффективного использования астаксантина в кормах, а также для выявления механизма антиоксидантной регуляции у японской болотной креветки.

 

1 Материалы и методы

1.1 Тестовый корм

В качестве основных источников белка использовались рыбная мука, мука из хлопковых семян, мука из соевых бобов, рапсовая мука и арахисовая мука, а в качестве основных источников жира - рыбий жир, масло из соевых бобов и фосфолипиды. Уровни фосфолипидов составляли 0, 20 и 40 г/кг соответственно, а уровень астаксантина - 0 и 4 г/кг соответственно. В зависимости от уровня фосфолипидов и астаксантина, добавляемых в корм, были сформированы шесть групп: контрольная группа без фосфолипидов и астаксантина (группа CON), группа с 20 и 40 г/кг фосфолипидов соответственно (группы PL1 и PL2), группа только с 4 г/кг астаксантина (группа AX), группа с 20 г/кг фосфолипидов + 4 г/кг астаксантина и группа с 40 г/кг фосфолипидов + 4 г/кг астаксантина соответственно (группы AXPL1 и AXPL2). Состав и содержание питательных веществ в рационах представлены в таблице 1. Твердые ингредиенты смешивались и измельчались через сито 80 меш, микроингредиенты, такие как витамины и минералы, смешивались методом пошагового расширения, затем добавлялись рыбий жир, масло соевых бобов и фосфолипиды, смешивались с водой для гомогенизации смеси, а затем прессовались в двухшнековом экструдере (LY Twin-screw Extruder, Changzhou Jiafa Pelleting and Drying Equipment Co., Ltd.) для формирования корма с размером частиц 1,0 мм, высушивались на воздухе при температуре окружающей среды, а затем хранились в герметичном контейнере при -20 ℃.

 

1.2 Схема эксперимента и управление культурой

Испытания проводились на рабочем месте выпускников Suzhou Yangcheng Lake National Modern Agricultural Demonstration Zone Development Co. Японская болотная креветка была приобретена в местном креветочном питомнике. Креветки содержались в закрытых бетонных аквариумах в течение 15 дней, в это время их кормили вместе с контрольной группой. Перед распределением по группам креветки голодали в течение 24 ч. 2160 креветок со средним весом (1,00±0,00) г были случайным образом разделены на 6 групп по 3 повтора по 120 креветок в каждой группе. Креветки были случайным образом распределены по 18 круглым пластиковым аквариумам объемом 400 л (300 л воды), в каждом из которых находилось по 120 хвостов, и в 3 аквариума вносился каждый рацион. Аквариумы были оборудованы горшками с эриокалициумом и сеткой из ПВХ в качестве крепления для креветок. Аквариумы кормили один раз в день в 07:30 и один раз в день в 18:30. Мертвых креветок собирали и взвешивали в течение всего периода культивирования. В качестве воды для аквакультуры использовалась вода озера Янчэн, отстоявшаяся не менее 48 часов. В течение тестового периода температура воды составляла 16-20 ℃, pH - 7,40-8,20, концентрация аммиака - менее 0,05 мг/л, а концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 6,40-7,30 мг/л путем непрерывной оксигенации. 1 раз в 3 дня мы отсасывали сточные воды и меняли 1/3 воды.

После 4 недель голодания в течение 24 ч общий вес креветок в каждом аквариуме был взвешен и подсчитан, 20 подопытных креветок были случайным образом взяты из каждого аквариума для непосредственной подготовки образцов для анализа, и еще 20 креветок были случайным образом взяты для теста на аммиачный стресс: концентрация аммиака в водоеме была скорректирована до ( 32,25±0,42) мг/л с помощью хлорида аммония (определена методом наноколориметрии [12]), введена в аквариум объемом 300 л, затем креветки были перенесены в аквариум, и после 24 ч стресса были отобраны образцы и проведен анализ.

 

1.3 Подготовка проб и методы анализа

1 .3.1 Подготовка образцов

Креветки были разложены на подносах со льдом, ткани гепатопанкреаса были промыты 4 ℃ предварительно охлажденной деионизированной воды, зафиксированы в 4% растворе формальдегида и хранились в холодильнике при 4 ℃ для гистоморфологического наблюдения. Остальные ткани печени были промыты 4 ℃ предварительно охлажденной деионизированной воды, помещены в пробирки EP, завернуты в фольгу и заморожены в жидком азоте и хранились в холодильнике при -80 ℃.

 

1 .3.2 Определение уровня питательности корма

Содержание влаги определяли методом низкотемпературной сублимационной сушки (сублимационная сушилка типа LJB18, Beijing Sihuan Scientific Instrument Factory Co., Ltd.), содержание сырого протеина определяли методом определения азота по Кьельдалю (GB 5009.5-2010), а содержание сырого жира - методом экстракции Сокслета (GB/T 14772-2008).

 

1 .3.3 Выделение и определение астаксантина из гепатопанкреаса

Астаксантин выделяли и определяли по методу Wang et al[ 13], 0,20 г образца ткани взвешивали и измельчали в ступке и пестике, 30 мл ацетона переносили неразрушенным в центрифужную пробирку объемом 50 мл для центрифугирования, экстракцию повторяли три раза, а надосадочную жидкость объединяли в сепарационной воронке. В сепарационную воронку добавляли определенную долю н-гексана, хлорида натрия (NaCl) и смесь дважды дистиллированной воды, тщательно перемешивали, давали отстояться, а затем в объемной колбе на 50 мл определяли объем. Содержание астаксантина в подготовленном образце определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Колонка SUPELCOSILTM LC-18-DB HPLC Column: 250 мм×4,6 мм, подвижная фаза: метанол:ацетонитрил = 9∶1, скорость потока: 1 мл/мин, длина волны обнаружения: 475 нм, температура колонки: комнатная температура, объем инжекции: 20 мкл, стандартная кривая астаксантина: y = 76,369x + 162,29 (R2 = 0,99).

 

1 .3.4 Измерение общей антиоксидантной способности (T⁃AOC) и активности общей супероксиддисмутазы (T⁃SOD) в гепатопанкреатической системе.

Взвесьте 0,10 г ткани гепатопанкреатической зоны, добавьте 9-кратный объем 0,86% предварительно охлажденного физиологического раствора, сделайте гомогенат с помощью высокоскоростного гомогенизатора (S10 High-speed Homogeniser, Shanghai Huyan Industrial Co., Ltd.), центрифугируйте в течение 10 мин при 2 500 об/мин, а затем измерьте активность T ⁃AOC и T ⁃SOD в супернатанте с помощью набора (Nanjing Jianjian Bioengineering Institute).

U/mg prot - количество единиц активности фермента на мг белка.

 

1 .3.5 Измерение экспрессии мРНК супероксиддисмутазы (СОД) в гепатопанкреатической клетчатке

Образцы тканей гепатопанкреатической зоны, хранившиеся при температуре -80 ℃, измельчали в жидком азоте и выделяли тотальную РНК в соответствии с инструкцией к Trizol. РНК переваривали с помощью DNase Ⅰ, концентрацию полученной РНК определяли с помощью ультрафиолетового спектрофотометра и электрофореза в 1% агарозном геле, затем синтезировали первую нить кДНК в соответствии с инструкциями набора PrimeScriptTM RT 1st strand cDNA Synthe⁃sis Kit и хранили при температуре -20 ℃ для запасного использования. Первая нить кДНК была синтезирована в соответствии с инструкциями набора PrimeScriptTM RT 1st strand cDNA Synthe⁃ sis Kit и хранилась при температуре -20 ℃. Реакционная система объемом 20 мкл состояла из 2 мкл разбавленного образца кДНК, 6 мкл стерилизованной дистиллированной воды, 10 мкл SYBR Premix Ex Taq и по 1 мкл восходящего и нисходящего праймеров в концентрации 8 мкмоль/л. Анализирующим прибором служил прибор Line Gene 9600 Fluorescence Quantitative PCR Instrument. Процедура реакции была следующей: предварительная денатурация при 95 ℃ в течение 20 с, 95 ℃ в течение 15 с, 60 ℃ в течение 2 с, всего 40 циклов; участок плавления при 95 ℃ в течение 15 с, 60 ℃ в течение 60 с и 95 ℃ в течение 15 с. Кривые плавления строились путем снижения температуры от 95 ℃ до 60 ℃ (4 ℃/с) для каждой реакции. Результаты анализировали по методу 2-ΔΔCt [ 15].

 

1 .3.6 Морфология гепатопанкреатических органов

Образцы гепатопанкреатической ткани, фиксированные формальдегидом, обезвоживались, становились прозрачными, погружались в парафин, встраивались и секционировались на толщину 5 мкм в соответствии с обычными процедурами секционирования тканей и окрашивались гематоксилин-эозином (HE). Срезы просматривали и фотографировали с помощью системы микровизуализации (микроскоп AXoskop, Carl Zeiss, Германия; цветная видеокамера JVCKY-F30, Япония).

 

1.4 Анализ данных

Статистический анализ данных проводили с помощью программы SPSS 22.0. Различия между группами анализировали с помощью одностороннего ANOVA и трехстороннего ANOVA (три фактора: фосфолипиды, астаксантин и аммиачный стресс), а для множественных сравнений значимых различий использовали метод Дункана. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). Различия между группами до и после аммиачного стресса изучали с помощью t-теста независимых выборок. p < 0,05 считалось значимым.

 

2 Результаты

2.1 Содержание астаксантина в гепатопанкреасе

Как показано на рис. 1, до аммиачного стресса (группа без стресса) содержание астаксантина в гепатопанкреасе групп PL1, PL2 и AX было увеличено по сравнению с группой CON, но разница не была значительной (P > 0,05); а содержание астаксантина в гепатопанкреасе групп AXPL1 и AXPL2 было значительно увеличено (P < 0,05). После аммиачного стресса (стрессовая группа) содержание астаксантина в гепатопанкреасе групп AX, AXPL1 и AX⁃ PL2 было значительно выше, чем в группе CON (P < 0,05), а в группе AXPL2 - значительно выше, чем в группе AX (P < 0,05). Между тем, содержание астаксантина в гепатопанкреасе групп AX, AXPL1 и AXPL2 после аммиачного стресса было значительно выше, чем до аммиачного стресса (P<0,05). Как показано в таблице 3, результаты трехстороннего ANOVA показали, что фосфолипиды, астаксантин и аммиачный стресс значительно повышали содержание астаксантина в гепатопанкреасе (P<0,05), и наблюдалось значительное двустороннее взаимодействие и трехстороннее взаимодействие между тремя факторами (P<0,05).

 

2.2 Антиоксидантные показатели гепатопанкреатической системы

Как показано на рисунках 2 и 3, до аммиачного стресса гепатопанкреатическая T ⁃AOC увеличилась во всех экспериментальных группах по сравнению с группой CON, среди которых группы PL1 и AX были значительно выше группы CON (P<0,05); активность гепатопанкреатической T ⁃SOD увеличилась во всех экспериментальных группах по сравнению с группой CON, но не было значительной разницы (P>0,05). После аммиачного стресса гепатопанкреатическая Т⁃AOC значительно увеличилась во всех экспериментальных группах по сравнению с группой CON (P<0,05), а активность гепатопанкреатической Т⁃SOD значительно увеличилась в группах PL2 и AXPL2 (P<0,05). Между тем, активность гепатопанкреатической Т ⁃AOC и Т ⁃SOD снизилась во всех группах после аммиачного стресса, гепатопанкреатическая Т ⁃AOC во всех группах после аммиачного стресса (кроме группы PL2) была значительно ниже, чем до аммиачного стресса (P<0.05), а активность гепатопанкреатической Т ⁃SOD в группе CON после аммиачного стресса была значительно ниже, чем до аммиачного стресса (P<0.05). Как показано в таблице 3, результаты трехстороннего ANOVA показали, что фосфолипиды значительно повышали активность гепатопанкреатической Т ⁃AOC и Т ⁃SOD' (P<0,05), астаксантин снижал активность гепатопанкреатической Т ⁃AOC и Т ⁃SOD' (P>0,05), а аммиачный стресс значительно снижал активность гепатопанкреатической Т ⁃AOC и Т ⁃SOD' (P<0,05). Взаимодействие двух на два и трех на три в отношении гепатопанкреатической T⁃AOC между тремя факторами было значительным (P<0,05).

 

2.3 Экспрессия мРНК СОД в гепатопанкреатической клетчатке

Как показано на рисунке 4, до аммиачного стресса экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД значительно повышалась в группах PL1 и PL2 по сравнению с группой CON (P<0,05), а в группе AX не было значительных изменений в экспрессии мРНК гепатопанкреатической СОД (P>0,05); экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД значительно снижалась в группах AXPL1 и AXPL2 (P<0,05) и была значительно ниже, чем в группах PL1 и PL2 (P<0,05). Экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД в группах AXPL1 и AXPL2 была значительно снижена (P<0,05) и значительно ниже, чем в группах PL1, PL2 и AX (P<0,05). После аммиачного стресса экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД значительно повышалась в группе PL2 по сравнению с группой CON (P<0,05), в группах PL1, AX и AXPL1 не было значительных изменений в экспрессии мРНК гепатопанкреатической СОД (P>0,05), а в группе AXPL2 экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД значительно снижалась (P<0,05). Между тем, экспрессия мРНК гепатопанкреатической СОД была снижена в группах CON, PL1 и PL2 (P>0,05) и повышена в группах AX, AXPL1 и AXPL2 (P>0,05) после аммиачного стресса по сравнению с таковой до аммиачного стресса. Как показано в таблице 3, трехсторонний ANOVA показал, что влияние фосфолипидного и аммиачного стресса на экспрессию мРНК СОД в гепатопанкреатической зоне было незначительным (P>0,05), в то время как астаксантин значительно снижал экспрессию мРНК СОД в гепатопанкреатической зоне (P<0,05). Эффекты астаксантина и аммиачного стресса, взаимодействия между астаксантином и аммиачным стрессом, а также взаимодействия между астаксантином и аммиачным стрессом были значительными (P<0,05).

 

2.4 Морфологическое строение гепатопанкреаса

Фотомикрофотографии предстрессовых участков гепатопанкреатической ткани японской болотной креветки (Litopenaeus vannamei), питавшейся различными рационами, представлены на рис. 5. Количество В-клеток в гепатопанкреатической ткани было относительно выше в группах PL1, PL2, AX, AXPL1 и AXPL2 по сравнению с группой CON.

 

3 Обсуждение

Содержание астаксантина в гепатопанкреасе сильно зависит от корма [ 16] . Добавление астаксантина само по себе может увеличить содержание астаксантина в гепатопанкреасе, а при наличии фосфолипидов накопление астаксантина в гепатопанкреасе еще больше усиливается. Астаксантин не растворим в воде, поэтому его всасывание в кишечнике происходит медленно, а эффективность его использования низка [17]. Фосфолипиды являются амфифильными, а их полярные головки имеют высокое сродство с гидроксильными группами в молекулах астаксантина[18], которые могут образовывать смешанные мицеллы с астаксантином и эмульгировать астаксантин[19], помогая тем самым солюбилизировать астаксантин, улучшить кишечное всасывание и увеличить содержание астаксантина в гепатопанкреасе. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что при добавлении астаксантина в корм следует одновременно добавлять достаточное количество фосфолипидов, чтобы улучшить утилизацию астаксантина.

Водные животные производят определенное количество свободных радикалов в процессе нормального роста и метаболизма, и еще больше свободных радикалов образуется в условиях стресса [20]. Накопление свободных радикалов в организме может повреждать ДНК и приводить к апоптозу, тем самым снижая показатели роста, устойчивость к заболеваниям и выживаемость водных животных [21]. В организме существуют защитные механизмы, направленные на уничтожение свободных радикалов, включая ферментативные (СОД и др.) и неферментативные (астаксантин и др.) антиоксидантные системы. Было установлено, что фосфолипиды стимулируют транскрипцию и трансляцию системы антиоксидантных ферментов, влияя на уровень экспрессии гена SOD и активность антиоксидантных ферментов, в то время как астаксантин обладает прямой антиоксидантной функцией[22] и способен эффективно поглощать свободные радикалы в клетке[9], уменьшая тем самым зависимость от антиоксидантов, стимулируемых ферментами, снижая активность печеночной и панкреатической SOD[23], и понижая экспрессию мРНК печеночной и панкреатической SOD[24]. В данном эксперименте фосфолипиды значительно повышали активность T ⁃SOD и T ⁃AOC, в то время как астаксантин значительно снижал экспрессию мРНК СОД в гепатопанкреатической ткани и снижал активность T ⁃SOD и T ⁃AOC в гепатопанкреатической ткани, что согласуется с приведенными выше данными.

 

В условиях слабого стресса водные животные избавляются от избыточного образования свободных радикалов, повышая активность T ⁃SOD и T ⁃AOC [25]. Однако в условиях сильного стресса активность антиоксидантных ферментов снижается [26]. В данном исследовании активность Т ⁃SOD и Т ⁃AOC в гепатопанкреатической зоне в группе CON была значительно ниже, чем до аммиачного стресса, что говорит о том, что концентрация аммиака в данном эксперименте была сильным стрессом для японской болотной креветки, превышающим ее нормальную физиологическую регуляцию и повреждающим антиоксидантную систему [27]. Добавление фосфолипидов и астаксантина по отдельности или в комбинации значительно повысило активность гепатопанкреатической Т ⁃ АОК (кроме группы PL2) и гепатопанкреатической Т ⁃ СОД, что позволяет предположить, что добавление фосфолипидов и астаксантина может способствовать повышению антиокислительной способности гепатопанкреаса и снижению повреждения, вызванного окислительным стрессом.

 

Примечательно, что в настоящем исследовании содержание астаксантина в гепатопанкреасе групп AX, AXPL1 и AXPL2 после аммиачного стресса было значительно выше, чем до аммиачного стресса. Это может означать, что неферментативная антиоксидантная система, представленная астаксантином, играет важную роль в окислительном стрессе Litopenaeus vannamei и даже может быть предпочтительным антиоксидантным путем у Litopenaeus vannamei [28]. После аммиачного стресса в гепатопанкреасе группы AXPL2 наблюдалось наибольшее увеличение содержания астаксантина, которое было значительно выше, чем в группе AX, что говорит о том, что более высокий уровень фосфолипидов может благоприятствовать эндогенному набору астаксантина японскими болотными креветками. В группах CON, PL1 и PL2, где в рацион не добавляли астаксантин, после стресса не наблюдалось значительного увеличения содержания астаксантина в гепатопанкреатической системе, что, вероятно, связано с низким уровнем накопления астаксантина в организме и недостаточным количеством астаксантина для его призыва.

По данным Чжао Вейхуна и других [29], В-клетки являются клетками гепатопанкреатической зоны, выполняющими функцию поглощения питательных веществ. Окислительное повреждение и токсичность могут уменьшить количество В-клеток в гепатопанкреасе [30]. В лабораторных условиях существует множество стрессовых факторов, таких как освещение и управление водой, и при обычном выращивании Litopenaeus vannamei фактически подвергается определенному экологическому стрессу. Относительное увеличение количества В-клеток в гепатопанкреате при использовании фосфолипидов и астаксантина по сравнению с группой CON предположительно связано с защитным действием фосфолипидов и астаксантина против окислительного повреждения в гепатопанкреате.

 

4 ВЫВОДЫ

В заключение следует отметить, что добавление фосфолипидов в рацион благоприятно сказывается на отложении экзогенного астаксантина и вызове эндогенного астаксантина японской болотной креветкой (Litopenaeus vannamei), а отложение астаксантина в организме может снизить активность гепатопанкреатической T ⁃AOC и T ⁃SOD японской болотной креветки (Litopenaeus vannamei) и оказать защитное действие на морфологию гепатопанкреаса.

 

Ссылки:

[ 1 ] qi ji , chen li qiao , sun sheng ming , et al. Потребность в холине молоди китайского варежкового краба Eriocheir sinensis при различных уровнях фосфолипидов [ J ] . Chinese Aquatic Science, 2013, 20 ( 2) : 372-379.

[ 2 ] DALL W. Каротиноиды и ретиноиды (витамин А) как основные факторы роста у пенеидных креветок (Penaeus semisulcatus) [ J] . Морская биология, 1995, 124 (2): 209-213.

[ 3 ] HUSSEIN G , GOTO H , ODA S , et al. Antihypertens⁃ ive potential and mechanism of action of astaxanthin : III. Antioxidant and histopathological effects in Антиоксидантные и гистопатологические эффекты у спонтанно гипертензивных крыс[ J] . Биологический и фармацевтический бюллетень, 2006, 29 (4) : 684-688.

[ 4 ] HIGUERA⁃CIAPARA I , FÉLIX⁃VALENZUELA L , GOYCOOLEA F M. Астаксантин: обзор его химии и применения [ J] . Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2006, 46 (2) : 185-196.

[ 5 ] YAMADA S , TANAKA Y , SAMESHIMA M , et al. Пигментация креветки (Penaeus japonicus) с помощью ротеноидов: Ⅰ. Влияние диетического астаксантина, β⁃каротина и кантаксантина на пигментацию[ J] . Аквакультура, 1990, 87 (3/4): 323-330.

[ 6 ] BAKER R T M , PFEIFFER A M , SCHÖNER F J , et al. Пигментирующая эффективность астаксантина и кантаксана у выращенного в пресной воде атлантического лосося, Salmo salar [J]. Animal Feed Science and Technology, 2002, 99 ( 1/2/3/4) : 97-106.

[7] HU Ling, ZENG Qiufeng, DING Xuemei, et al. Влияние диетического эмульгатора соевого лецитина на показатели роста, использование питательных веществ и биохимические показатели сыворотки крови цыплят-бройлеров [ J ] . Journal of Animal Nutrition, 2012, 24 (10) : 1928-1938.

[ 8 ] CAI X H , GRANT D J W , WIEDMANN T S. Анализ солюбилизации стероидов мицеллами желчных солей [ J] . Журнал фармацевтических наук, 1997, 86 ( 3) : 372-377.

[ 9 ] CACECI T , NECK K F , LEWIS D D H , et al. Ультраструктура гепатопанкреаса тихоокеанской белой креветки Penaeus vannamei ( Crustacea : Decapoda) [ J] . Журнал Морской биологической ассоциации Великобритании, 1988, 68 (2) : 323-337.

[ 10] FENG L , CHEN Y P , JIANG W D , et al. Модуляция иммунного ответа, физического барьера и связанных с ними сиг⁃ нализирующих факторов в жабрах молоди карпа ( Ctenopharyngodon idella), которых кормили диетой с добавлением фосфолипидов[ J] . Иммунология рыб и моллюсков, 2016, 48: 79-93.

[ 11] Wang Z, Cui G-T, Cai Chun-Fang, et al. Фосфолипиды влияют на потребность в жире в корме японской болотной креветки, Penaeus japonicus [ J] . Journal of Animal Nutrition, 2018, 30( 6) : 222-231.

[ 12] Zou Li-Chang, Ren Chang-Yi, Wang Zhi-Cheng, et al. Влияние острого стресса аммиака и азота на уровень смертности, скорость потребления кислорода и точку удушья японской болотной креветки (Macrobrachium nipponensis) [ J] . Ocean and Lake Marsh, 2015, 46( 1) : 206-211.

[ 13] WANG Z, CAI C F, CAO X M, et al. Добавка диетического астаксантина смягчила окислительное повреждение, вызванное хроническим стрессом с высоким уровнем pH, и повысила концентрацию астаксантина в панцире китайского варежкового краба Erio⁃ cheir sinensis[J]. концентрация астаксантина в панцире китайского варежкового краба Erio⁃ cheir sinensis[J] .Aquaculture, 2018, 483 :230-237.

[ 14] Jurin Hara. Исследование схемы очистки накопления микроцистинов в раках и японских болотных креветках [ D] . Докторская диссертация. Сяньян: Северо-Западный сельскохозяйственный и лесохозяйственный университет науки и техники, 2016.

[ 15] LIVAK K J , SCHMITTGEN T D. Анализ данных об относительной экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени и метода 2-ΔΔCt [ J] . Methods , 2001 , 25 ( 4) : 402-408.

[ 16] Ma Nan, Long Xiaowen, Zhao Lei, et al. Влияние кормовой добавки с синтетическим астаксантином на развитие гонад, цвет и антиоксидантную способность взрослых самок китайских крабов-русалок, Eriocheir sinensis [ J] . Journal of Aquatic Biology, 2017, 41( 4) : 755-765.

[ 17] STOREBAKKEN T , NO H K. Пигментация радужной форели [ J] . Аквакультура, 1992, 100( 1/2/3) : 209- 229.

[ 18] BRITTON G. Structure and properties carotenoids inrelation to function [ J] .FASEB Journal, 1995, 9( 15) : 1551-1558.

[ 19] OLSEN R E , KIESSLING A , MILLEY J E , et al. Влияние источника липидов и желчных солей в рационе атлантического лосося, Salmo salar L., на уровень астаксантина в крови [ J Aquaculture, 2005, 250( 3/4) : 804-812.

[ 20] HOLDOM M D , LECHENNE B , HAY R J , et al. Pro⁃ duction and characterisation of recombinant Aspergil⁃ lus fumigatus Cu , Zn superoxide dismutase and its recognition by immune human seres [ J] . распознавание иммунными сыворотками человека[ J] . Journal of Clini⁃ cal Microbiology, 2000, 38( 2) : 558-562.

[ 21] WANG W N , ZHOU J , WANG P , et al. Окислительный стресс, повреждение ДНК и экспрессия генов антиоксидантных ферментов у тихоокеанской белой креветки Litopenaeus van⁃ namei при воздействии острого pH-стресса [ J] . namei при воздействии острого pH-стресса[ J] . Compara⁃ tive Biochemistry and Physiology Part C : Toxicology & Pharmacology, 2009, 150( 4) : 428-435.

[ 22] Bui Su Rui , Guan Yue Qiang , Ma Yun Ting . Влияние кормовой добавки с астаксантином на рост, выживаемость и антиоксидантную способность Penaeus vannamei [ J] . Aquatic Sciences, 2009, 28( 3) : 126-129.

[ 23] WANG W N , WANG A L , ZHANG Y J. Влияние диетического повышенного уровня селена и концентрации нитритов на клеточный защитный ответ Penaeus vannamei [ J] .Аквакультура, 2006, 256 (1/2/3/4) : 558-563.

[ 24] XIE S W , FANG W P , WEI D , et al. Диетическая добавка Haematococcus pluvialis улучшила иммунную способность и способность переносить низкую соленость у Посткларвальная белая креветка Litopenaeus vannamei [ J] . Fish & Shellfish Immunology, 2018, 80: 452-457.

[ 25] DUAN Y F , ZHANG Y , DONG H B , et al. Effect of desiccation on oxidative stress and antioxidant re⁃ sponse of the black tiger shrimp Penaeus monodon [ J] . Иммунология рыб и моллюсков, 2016, 58: 10-17.

[ 26] GUNAWICKRAMA S H N P , AARSAETHER N , ORBEA A , et al. PCB77 ( 3 , 3 ′ , 4 , 4 ′ ⁃tetrachlorobiphe⁃ nyl) co⁃exposure prolongs CYP1A induction , and sus⁃ tains окислительный стресс у тюрбо, Scoph⁃ thalmus maximus, подвергшегося воздействию B( a) P⁃, в долгосрочном исследовании [ J] . Aquatic Toxicology, 2008, 89( 2) : 65-74.

[ 27] HONG Mei-ling , CHEN Liqiao , GU Shunzhang , et al. Влияние стресса, вызванного аммиачным азотом, на иммунные показатели и структуру гепатопанкреаса Eriocheir sinensis [ J] . Chinese Aquatic Science, 2007, 14 (3) : 412-418.

[ 28] ZHANG J , LIU Y J , TIAN L X , et al. Влияние диетического астаксантина на рост, антиоксидантную способность и экспрессию генов у тихоокеанской белой креветки Litopenaeus vannamei [ J] . Aquaculture Nutrition, 2013, 19 ( 6) :917-927.

[ 29] Zhao Weihong , Wang Zisheng , Zhang Yuxia , et al. Влияние эстрадиола на содержание жирных кислот и гистологическую структуру гепатопанкреаса японской болотной креветки (Litopenaeus vannamei) [ J] . Морское рыболовство, 2014, 36( 6) : 542.

[ 30] PINHO G L L , DA ROSA C M , YUNES J S , et al. Токсические эффекты микроцистинов в гепатопанкреасе у

Эстуарный краб Chasmagnathus granulatus ( Deca⁃ poda , Grapsidae ) [ J] . Сравнительная биохимия и физиология Часть C : Токсикология и фармакология, 2003, 135 (4) : 459-468.