Мелкомасштабное пилотное исследование по производству астаксантина с использованием радужных красных водорослей

 Микроводоросли получили широкое признание международного сообщества как быстрорастущий, адаптируемый и чистый источник энергии из биомассы с высоким выходом биомассы[1] . Помимо того, что микроводоросли являются источником биоэнергии, они также эффективно очищают углекислый газ в городских сточных водах и промышленных дымовых газах, поэтому широкомасштабное культивирование микроводорослей имеет большое значение для решения проблем нехватки энергии, парникового эффекта и загрязнения окружающей среды, которые становятся все более и более заметными [2-4]. Между тем, биомасса микроводорослей может быть переработана различными способами для получения различных видов биотоплива и высокоценных химических веществ [5-6]. В частности, из Erythrocystis rainforestii можно получить астаксантин - высокоценный продукт, который является "супер-антиоксидантом", широко используемым в аквакультуре, кормах, косметике, нутрицевтиках, фармацевтике, пищевой и других отраслях промышленности [7].

 

Haematococcus pluvialis - это пресноводная одноклеточная зеленая водоросль [8]. При определенных условиях культивирования она способна накапливать каротиноиды, содержащие более 80% астаксантина и эфиров астаксантина [9-10], и признана одним из высококачественных организмов в природе, производящих высокий уровень натурального астаксантина, и поэтому является наиболее перспективным источником натурального астаксантина для крупномасштабного коммерческого промышленного производства. Это объясняется большим потенциалом астаксантина на мировом рынке [11]. Культура R. rainbowii и ее биологический потенциал для получения высокоценных продуктов астаксантина нуждаются в более полном изучении.

В данной работе мы использовали Haematococcus pluwialis в качестве экспериментального материала для изучения влияния питания, pH, температуры и интенсивности света на его рост и размножение с целью понимания оптимального питания, pH, температуры, интенсивности света и светового цикла, а также углубления понимания взаимосвязи между ростом и размножением Haematococcus pluwialis и факторами окружающей среды. Цель - углубить понимание взаимосвязи между ростом и размножением Rhodococcus rainbowensis и факторами окружающей среды, а также создать основу для оптимизации условий массовой культуры Rhodococcus rainbowensis.

 

1 Экспериментальный компонент

1.1 Инструменты и реагенты

Основные приборы: световой инкубатор MGC-400B, Shanghai Xinmiao Medical Instrument Manufacturing Co., Ltd; спектрофотометр UV1101 UV-visible, Shanghai Huawen Medical Nuclear Instrument Co., Ltd; электронные весы AL204-IC, METTLER TOLEDO INSTRUMENT (Shanghai) Co; Ltd.; вакуумная сублимационная сушилка Scientz-10N, Ningbo Xinzhi Bio-technology Co., Ltd.; чайник для паровой стерилизации с вертикальным давлением LS-B50L, Shanghai Huawei Medical Nuclear Instrument Co; PHSJ-4A pH-метр, Shanghai Precision Scientific Instrument Co; TES-1332A цифровой измеритель освещенности, Thai Electronic Industry Co.

Препараты: NaNO3, K2HPO4, MgSO4 -7H2 O, CaCl2 -2H2 O, лимонная кислота, цитрат железоаммонийный, EDTANa2 , Na2 CO3.

 

1.2 Экспериментальные материалы и методы

1.2.1 Экспериментальные виды водорослей и среды

Haematococcus pluvialis (FACHB-712) был приобретен в банке пресноводных водорослей Института водной биологии Китайской академии наук. Водоросли последовательно культивировали в 50 мл, 100 мл, 250 мл, 500 мл, 1000 мл и 2000 мл в качестве лабораторных образцов.

Культивируйте водоросли в инкубаторе. Клетки водорослей инкубировали в световом инкубаторе со средой BG11, а бутылку встряхивали 3~4 раза в день. Температура инкубации составляла 25±1 ℃, а соотношение свет/темнота было

pH среды составлял 7,0, а интенсивность освещения - 50 мкмоль-м-2 - с-1. 1.2.2 Определение pH раствора водорослей

Значение pH водорослевой жидкости определяли с помощью pH-метра (Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.).

 

1.2.3 Измерение силы света

Интенсивность света источника освещения измеряли с помощью цифрового измерителя освещенности TES-1332A (Thai Electronic Industries Co., Ltd.).

 

1.2.4 Определение значения OD сока водорослей

Значение OD раствора водорослей при оптимальной длине волны поглощения определяли на УФ-видимом спектрофотометре UV1101 (Shanghai Huawen Medical Nuclear Instrument Co., Ltd.).

 

1.2.5 Определение сухого веса Rhodococcus rainbowensis

Возьмите 10 мл водорослевой жидкости, перенесите ее во взвешенную центрифужную пробирку объемом 10 мл, центрифугируйте при 8000 об/мин в течение 5 мин при 4 ℃, удалите супернатант, центрифугируйте и промойте водоросли в пробирке деионизированной водой 2 раза, затем поместите супернатант в сублимационную сушилку, а затем взвесьте массу высушенной пробирки, и разница массы до и после центрифугирования является значением сухого веса. Сухой вес водорослей и поглощение водорослевой жидкости были измерены, чтобы удовлетворить линейной зависимости в диапазоне 0 ~ 1,1 г/л: W(г/л)= 0,3387×OD680, R2 =0,9913; таким образом, сухой вес водорослей может быть выражен через значение поглощения.

 

1.2.6 Определение содержания астаксантина

Экстракцию и определение астаксантина проводили по литературным данным[12] с некоторыми изменениями. Возьмите VbmL сока водорослей, центрифугируйте при 8000 об/мин в течение 10 мин, добавьте 5 мл раствора метанола/KOH (30% метанола (v/v) и 5% KOH (массовая концентрация)) к супернатанту, затем хорошо встряхните и нагрейте раствор при 65 ℃ в течение 15 мин. После окончания бани, центрифугируйте при 8000 об/мин в течение 5 мин, центрифугируйте и промойте тело водорослей в пробирках DI-водой два раза, и добавьте 5 мл диметил квасцов (DMSO) к супернатанту, ультразвуком в течение 10 мин, и соберите супернатант в пробирку путем центрифугирования. 5 мл диметил квасцов (ДМСО), ультразвуковое измельчение 10 мин, центрифугирование, сбор надосадочной жидкости в объемную колбу, повторное добавление диметил квасцов для повторения экстракции до тех пор, пока водорослевый осадок не станет белым, объем объема Va. Наконец, измеряли значение светопоглощения экстракта при 490 нм и рассчитывали концентрацию астаксантина в экстракте в соответствии с уравнением 1.1, c (мг/л). Концентрацию астаксантина c (мг/л) в экстракте рассчитывали согласно уравнению 1.1. Согласно уравнению 1.2, эту концентрацию сравнивали с соответствующим сухим весом биомассы, чтобы получить соответствующее содержание астаксантина C (мг/г).

 

2 Результаты и обсуждение

2.1 Влияние трофических режимов на биомассу Rhodococcus rainbowensis

Для реализации крупномасштабной экспресс-культуры Rhodococcus rainbowensis было исследовано влияние режима питания на ее рост. Водоросли собирали центрифугированием на стадии роста, в качестве базовой среды использовали BG11, концентрацию раствора водорослей регулировали до D680=0,05, в качестве источника углерода использовали типичный источник углерода, состоящий из 1 г/л ацетата натрия и 1 г/л глюкозы, чтобы реализовать смешанную культуру водорослей, одновременно проводили контроль холостой группы.

На рисунке 1 показано, что быстрый рост R. rainbowii был достигнут путем добавления органического источника углерода, который мог быстро увеличить биомассу R. rainbowii за короткий промежуток времени, тем самым расширяя виды водорослей в качестве инокулята в культуре. В процессе 20-дневной инкубации контрольная группа автотрофной культуры вошла в стадию быстрого роста через 14-15 дней с урожайностью водорослей 0,0314 г/(л-д) (средняя урожайность 0,0204 г/(л-д)); для двух групп экспериментов с добавлением источников углерода средняя урожайность группы с добавлением ацетата натрия составила 0,0163 г/(л-д), а максимальная урожайность достигала 0,0228 г/(л-д); Средняя скорость роста в группе с глюкозой составила 0,0321 г/(л-д), что было быстрее, чем в других группах, и она была выбрана в качестве быстрого метода культивирования водорослей. Таким образом, глюкоза может быть использована в качестве источника углерода для достижения быстрого культивирования водорослей в крупномасштабной культуре Rhodococcus pyrenoidus.

 

2.2 Влияние изменения pH на биомассу Rhodococcus rainbowensis

Водоросли были собраны центрифугированием в период роста, абсорбция раствора водорослей была отрегулирована до OD680 = 0,05, начальный pH среды был отрегулирован до 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0 с помощью NaOH, соответственно, и среда была помещена в темноту на 12 ч, а затем помещена в световой инкубатор для статического культивирования, в качестве среды была выбрана среда BG11, и колбу встряхивали три раза в день. В качестве среды для культивирования была выбрана среда BG11, колбы встряхивали три раза в день. При температуре инкубации 25±1 ℃, интенсивности света 50 мкмоль-м-2 - с-1 и соотношении свет-темнота 12 ч:12 ч, значения OD680 культур измерялись при каждом значении pH путем отбора проб каждый день в течение 14-дневного цикла инкубации, а исходный pH поддерживался добавлением NaOH.

 

На основании литературных данных можно сделать вывод, что оптимальный уровень pH для Rhodococcus rainbowensis является слабощелочным. Однако из-за различий в видах водорослей, используемых в разных лабораториях, подходящие условия рН также сильно варьируются. На рис. 2 показаны условия pH для водоросли FACHB-712, использованной в данном эксперименте. Из кривых роста водорослевых клеток видно, что в первые 4 дня при разных условиях рН не было очевидной разницы в росте водорослевых клеток, а с 5-го дня и до конца 14-го дня инкубации разница в росте начала постепенно увеличиваться. pH=8,0 был наиболее подходящим для роста Rhodococcus pyrenoidus, скорость роста при pH=6,0, 7,0 и 9,0 была не такой быстрой, как при pH=8,0, но рост все равно был хорошим. Однако при pH=10,0 скорость роста R. rainbowii сохранялась только в течение первых 6 дней. После 6-го дня количество клеток стало уменьшаться, и большинство клеток превратились в неподвижные споры под микроскопом, что означает, что на рост R. rainbowii отрицательно повлияла щелочность.

 

2.3 Влияние изменения температуры на фотосинтетический рост Rhodococcus rainieri

Водоросли были собраны центрифугированием в период роста, когда водоросли уже разрослись и объем водорослей был достаточным. Абсорбция раствора водорослей была отрегулирована до D680=0,6, и значения OD680 культур были измерены при различных температурах от 15 до 18 °C, 22-23 °C, 25-27 °C, 15-18 °C и 30-33 °C. Значения OD680 культур при различных диапазонах температур были собраны центрифугированием и собраны в период роста, когда водоросли уже разрослись и объем водорослей был достаточным, Значения OD680 культур были измерены при различных температурных диапазонах 15~18 ℃, 22~23 ℃, 25~27 ℃, 15~18 ℃ и 30~33 ℃. Влияние изменения температуры на рост Rhodococcus rainbowii было исследовано на примере гетеротрофного роста Rhodococcus rainbowii с высокой плотностью водорослей. На рисунке 3 показаны кривые роста Rhodococcus rainbowii при различных температурных условиях. При 22~23 ℃ и 25~27 ℃ рост Rhodococcus rainbowensis был быстрым, а максимальная концентрация водорослей достигла 1,8~2,0 г/л после 2~3 недель инкубации. Однако скорость роста Rhodococcus rainbowensis быстро снижалась при температуре ниже 15~18 ℃, а максимальная концентрация микроводорослей была ниже 0,8 г/л после 14 дней инкубации, и рост микроводорослей в основном прекращался при температуре выше 30~33 ℃. Диапазон колебаний температуры должен контролироваться в небольшом диапазоне, что указывает на слабую устойчивость Rhodococcus rainbowensis к температуре.

 

2.4 Влияние изменения интенсивности света и фотопериода на рост Rhodococcus rainieri

Исследовали влияние различных интенсивностей света на рост и накопление астаксантина Rhodococcus rainbowensis. Интенсивность света контролировали на уровне 50 и 200 мкмоль-м-2-с-1 при оптимальных температурах и pH, соответственно, а режимы освещения - 24 ч непрерывного света и 12 ч:12 ч свет-темнота. Процедура инкубации была следующей: в треугольные конические колбы объемом 500 мл вносили растущие водоросли в начальной концентрации 0,3 г/л, температура инкубации контролировалась при 22±1 ℃, а время инкубации составляло 14 д. Периодически отбирались пробы для определения биомассы микроводорослей в процессе инкубации.

 

2.4.1 Влияние изменений интенсивности света и фотопериода на накопление биомассы Rhodococcus rainbowensis

Как показано на рис. 4, при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 рост Rhodococcus rainbowensis проходил полный жизненный цикл, т.е. на ранней стадии инкубации (1~3 дня) рост водоросли был медленным, чтобы адаптироваться к новой среде, затем она быстро росла в период роста, а после достижения максимального роста через 10 дней культивирования быстро переходила в период увядания. При непрерывном освещении в течение 24 часов Rhodococcus rainieri необходимо было пройти медленный период акклиматизации перед вступлением в период роста (4-10 дней), в то время как при освещении 12 ч:12 ч микроводоросль могла вступить в период роста практически без акклиматизации, и ее биомасса быстро увеличивалась. Это может быть связано с тем, что непрерывный свет влиял на механизм фотосинтеза микроводорослей, поэтому микроводоросли адаптировались к новой среде и затем росли медленно и стабильно, в то время как период освещения 12 ч:12 ч был таким же, как у культуры водорослей, поэтому микроводорослям не нужно было менять путь фотосинтеза, и они могли расти стабильно.

 

При сравнении различных продолжительностей освещения наибольшая биомасса 0,26 г/л была получена при интенсивности света 50 мкмоль-м-2-с-1 в течение 24 ч, что в 1,2 раза превышало максимальную биомассу 0,22 г/л при соотношении свет-темнота 12 ч:12 ч; а наибольший биологический сухой вес 0,54 г/л был получен при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 в течение 24 ч непрерывного освещения, что в 1,39 раза превышало биомассу 0,42 г/л при соотношении свет-темнота 12 ч:12 ч. Наибольший сухой вес 0,54 г/л был получен при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1, что было в 1,39 раза выше, чем 0,42 г/л в условиях культуры 12 ч:12 ч свет-темнота. Таким образом, непрерывное освещение в течение 24 часов было более благоприятным для быстрого увеличения биомассы R. rainbowii.

Сравнение различных интенсивностей света показало, что рост и накопление биомассы Rhodococcus rainbowensis при высокой интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 были значительно выше, чем при низкой интенсивности света 50 мкмоль-м-2-с-1. Максимальная биомасса Rhodococcus rainbowensis при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 составила 0,42 г/л при инкубации 12 ч:12 ч, что было в 1,93 раза выше максимальной биомассы 0,22 г/л при инкубации с низким освещением; максимальная биомасса Rhodococcus rainbowensis при 24 ч непрерывной инкубации составила 0,22 г/л при 24 ч инкубации. Максимальная биомасса 0,42 г/л при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 была в 1,93 раза выше, чем 0,22 г/л при слабом свете. При 24-часовой инкубации с непрерывным светом максимальная биомасса при интенсивности света 200 мкмоль-м-2-с-1 могла достичь 0,50 г/л, что было в 1,39 раза выше, чем 0,24 г/л при интенсивности света 50 мкмоль-м-2-с-1. Таким образом, высокая интенсивность света благоприятствует быстрому накоплению биомассы в культуре R. rainbowii.

 

2.4.2 Влияние изменений интенсивности света и фотопериода на накопление биомассы Rhodococcus rainbowensis

На график было нанесено максимальное содержание астаксантина в течение цикла роста, так как производство астаксантина Rhodococcus rainieri подвергалось стрессу из-за высокой интенсивности света и длительных фотопериодов во время эксперимента.

На рис. 5 показано, что в зависимости от интенсивности света содержание астаксантина, накопленного Rhodococcus rainbowensis при 200 мкмоль-м-2-с-1, было значительно выше, чем при низкой интенсивности света, независимо от того, была ли интенсивность света 12 ч:12 ч или 24 ч непрерывного освещения. Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что интенсивность света является важным фактором, индуцирующим накопление астаксантина в R. rainbowii, а наибольшее содержание астаксантина в микроводорослях при высокой интенсивности света достигло 26,47 мг/л, что в 2,63 раза превышало наибольшее содержание 10,05 мг/л при низкой интенсивности света, так что высокая интенсивность света более благоприятна для быстрого накопления астаксантина. Что касается светового цикла, то содержание астаксантина было значительно выше при непрерывном освещении в течение 24 часов, чем при световом цикле 12 часов:12 часов, независимо от того, составляла ли интенсивность света 50 мкмоль-м-2-с-1 или 200 мкмоль-м-2-с-1. Максимальное содержание астаксантина 26,47 мг/л было в 2,07 раза выше, чем 12,73 мг/л при непрерывном освещении 12 ч:12 ч, что указывает на то, что непрерывное освещение в течение 24 ч было более благоприятным для накопления астаксантина в Rhodococcus rainbowensis. Кроме того, увеличение интенсивности света способствовало росту биомассы и накоплению астаксантина у R. rainbowii быстрее, чем увеличение времени освещения.

 

2.4.3 Окрашивание Rhodococcus rainieri в условиях стресса

Микроструктура трофических клеток показана на рисунке (b). На рисунке (a) показана стадия трофического роста Rhodococcus rainbowensis, демонстрирующая рост зеленой суспензии, а микроструктура трофических клеток показана на рисунке (b). В условиях окружающей среды, т.е. при высокой освещенности, R. rainbowii окрашивался в красный цвет и накапливал астаксантин, который превращался в водорослевый порошок R. albicans, как показано на рис.

(c), наблюдаемая структура показана на рис. (d).

 

3 Заключение

( 1 ) Влияние питания, pH, температуры, продолжительности освещения и интенсивности света на рост биомассы и накопление астаксантина Rhodococcus rainbowensis было очевидным. Добавление 1 г/л глюкозы в качестве источника углерода может явно увеличить биомассу водорослей; pH=8,0, 22~27 ℃, высокая интенсивность света (200 мкмоль-м-2-с-1) и непрерывный свет (24 ч) были наиболее подходящими условиями для накопления биомассы Rhodococcus rainbowensis, не только это, но и то, что интенсивность света является важным фактором для стимулирования накопления астаксантина в Rhodococcus rainbowensis, а высокая интенсивность более благоприятна для увеличения содержания астаксантина. Интенсивность света является важным фактором для индуцирования накопления астаксантина в Rhodococcus rainbowensis, а высокая интенсивность света более благоприятна для содержания астаксантина.

(2) Поскольку для роста биомассы и накопления астаксантина в красных водорослях требуются разные условия культивирования, для производства следует использовать двухэтапный подход, т.е. сначала накапливать биомассу в оптимальных условиях окружающей среды, а затем вызывать накопление большого количества астаксантина в стрессовых условиях.

 

Ссылки:

[1] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]. Biotechnology Advances , 2007, 25(3): 294-306 .

[2] Brennan L, Owende P. Biofuels from microalgae-A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products[J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews, 2010, 14(2):557-577.

[3]Christenson L , Sims R. Производство и сбор микроводорослей для очистки сточных вод, биотоплива и биопродуктов [J].Biotechnology Advances. 2011 , 29(6):686-702.

[4] Cheng J, Li K, Yang Z B, et al. Gradient domestication of Haematococcus pluvialis mutant with 15 % CO2 to promote biomass growth and astaxanthin yield [J ].Bioresource Technology, 2016 , 216 : 340-344.

[5] Zhang Wenwen, Chu Huaqiang, Zhou Xuefei, et al. Прогресс в исследовании технологии соединения очистки сточных вод и культуры микроводорослей[J] . Современная химическая промышленность, 2018(1):53-57 .

[6] Kang C D, An J Y , Park T H , et al. Биосинтез астаксантина при одновременном поглощении азота и полимера зеленой водорослью Haematococcus pluvialis в первично очищенных сточных водах [J]. Биохимический инженерный журнал, 2006, 31(3): 234-238 .

[7] Grung M , Dsouza F M L , Borowitzka M , et al. 51. Secondary Carotenoids ．2. Haematococcus-Pluvialis Aplanospores as a Source of (3s , 3's)-AstaxanthinEsters [J].Journal of Applied Phycology, 1992. 4(2):165-171.

[8] M R D. Carotenogenesis in Haematococcus pluvialis [J].Nature, 1954, 175(4444) : 42 .

[9] Grung M , Dsouza F M L , Borowitzka M , et al. 51. Secondary Carotenoids.2. Haematococcus-Pluvialis Aplanospores as a Source of (3s, 3's)- AstaxanthinEsters [J].Journal of Applied Phycology, 1992. 4(2):165-171.

[10] Harker M, Tsavalos A J, Young A J. Факторы, ответственные за образование астаксантина в хлорофите Haematococcus pluvialis[J]. Bioresource Technology, 1996 , 55(3):207-214.

[11] Koller M, Muhr A, Braunegg G. Microalgae as versatile cellular factories for valued products [J].Algal Research, 2014, 6 : 52-63 .

[12] Boussiba S, Fan L, A V. Усиление и определение накопления астаксантина в зеленой водоросли Haematococcus pluvialis[J] . Методы в энзимологии, 1992 , 213 : 386-391 .