Как извлечь астаксантин из дрожжей Red Fife?

 Астаксантин, также известный как астаксантин, представляет собой кетокаротиноид, окисленный из β-каротина, с молекулярной формулой C40H52O4 и химическим названием 3,3′-дигидрокси-4,4′-дикето-β′-каротин. β′-каротин растворим в жирах [1] и может быть растворим в большинстве органических реагентов, таких как ацетон, хлороформ, этанол и большинство эфиров [2], но нерастворим в воде. Он нерастворим в воде и имеет темно-красный цвет. Астаксантин обладает сильными антиоксидантными, противовоспалительными, противораковыми, антивозрастными, иммуноукрепляющими и красящими свойствами и имеет широкий спектр применения в пищевой, фармацевтической, кормовой и косметической промышленности [3].

 

Астаксантин производится в основном химическим и биологическим путем. Существует две основные конформации химически полученного астаксантина: 3S,3′R и 3R,3′S, и две конформации биологически полученного астаксантина: 3R,3′R, выделенный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (рис. 1), и 3S,3′S, выделенный из красной водоросли Rhodococcus pyrenoidus (рис. 5).

 

По данным GVR, около 95% астаксантина на рынке синтезируется химическим путем [6], однако химический синтез астаксантина занимает много времени, сложен и приводит к образованию большого количества побочных продуктов [7], поэтому люди предпочитают использовать натуральный синтетический астаксантин [8]. В последние годы рыночная стоимость натурального астаксантина растет, и мировой рынок астаксантина оценивается в 2,83 млрд долларов США к 2024 году [6].

 

Биосинтезированный астаксантин в основном получают из Rhodococcus rainieri [9] и Saccharomyces cerevisiae [10]. Из-за суровых условий произрастания, жестких требований к освещенности территории выращивания и высоких требований к качеству воды для культивирования Rhodococcus aureus в Китае подходят только Юньнань и Шаньдун, что приводит к тому, что общий объем производства астаксантина из Rhodococcus aureus невысок, а загрязнение окружающей среды является серьезным [11]. В последние годы популярным микроорганизмом для производства астаксантина стали дрожжи красной фифы. Дрожжи Red Fife - это дрожжи природного происхождения, продуцирующие астаксантин, похожие на Saccharomyces cerevisiae, которые способны к различным мутациям и генетической модификации, а также способны к высокоплотной ферментации для получения большого количества астаксантина природного происхождения, что делает их перспективным микроорганизмом для производства астаксантина [12]. Процесс производства астаксантина показан на рис. 2, однако процесс экстракции астаксантина из дрожжей Red Fife является важным фактором, ограничивающим его востребованность на рынке. В связи с этим в данной статье описывается ход процесса разрушения стенок и экстракции астаксантина из Saccharomyces cerevisiae с целью создания справочной информации для последующих исследований по экстракции астаксантина из Saccharomyces cerevisiae.

 

1 Разведение дрожжей Red Fife

Клеточная стенка Saccharomyces cerevisiae толще, чем у Saccharomyces cerevisiae, а астаксантин находится в клеточной мембране, поэтому для извлечения астаксантина необходимо сначала разрушить клеточную стенку. Обычно для разрушения клеточной стенки используются физические, химические, биологические и комбинированные методы.

 

1.1 Физическое разрушение

Физический метод разрушения стенок в основном заключается в механической вибрации или трении для разрушения клеточной стенки дрожжей красной фифы, этот метод прост и легко реализуем, имеет низкую стоимость, но в процессе разрушения стенок может выделяться большое количество тепла, что приводит к медленной деградации астаксантина, поэтому необходимо охлаждение в процессе разрушения стенок. Гогате и другие [13] использовали 3 моль/л молочной кислоты в качестве среды, этанол в качестве экстракционного растворителя, и разрушали стенки в течение 15 мин при условии ультразвуковой мощности 80 Вт, рабочий цикл 60%. GOGATE и др. [13] использовали 3 моль/л молочной кислоты в качестве среды и этанол в качестве экстракционного растворителя, и экстрагированный астаксантин был разбит при ультразвуковой мощности 80 Вт и рабочем цикле 60% в течение 15 мин, а степень извлечения астаксантина достигла 90%. Низкочастотный резонанс (НЧР) - это новый и экологичный метод физического разрушения, и некоторые исследователи обнаружили, что степень разрушения составляет 99,9% при резонансной частоте 35 Гц и времени резонанса 75 минут [15]. Кроме того, срезание стеклянных шариков также является экологичным и эффективным методом разрушения стенок. Чен и др. [16] использовали стеклянные шарики с размером частиц 1 мм для измельчения красных дрожжей Fife и обнаружили, что степень извлечения астаксантина составила 65 % при соотношении жидкости и материала 20:1 (L:g), дозировке стеклянных шариков 200 г/л (стеклянные шарики:ферментационный бульон) и времени измельчения 6 ч. Результаты этого исследования приведены в таблице ниже.

 

1.2 Химическая разбивка

Химическое разрушение - это химическая деградация активного вещества в клеточной стенке S. rosenbergii, обнажающая клеточную мембрану S. rosenbergii для облегчения извлечения астаксантина. Основными методами химического разрушения являются диметилсульфоксид, кислота и щелочь. Диметилсульфоксид токсичен и обычно используется в качестве лабораторного метода экстракции, но не для последующей экстракции. Кислотное разрушение стенок обычно используется для разрушения красных клеток дрожжей Fife для извлечения группы ДНК, но этот метод обычно проводится при высокой температуре, которая склонна к деградации астаксантина, а кислота в этом методе повреждает структуру астаксантина, и последующий процесс деацидификации довольно сложный, поэтому он не подходит для последующей экстракции астаксантина.

 

SILVA et al. [17] использовали диметилсульфоксид для разрушения стенок дрожжей красной фифы, соотношение сухого веса дрожжей красной фифы и диметилсульфоксида 1:40 (г:мл), температура нагрева 55 ℃, время вихревого движения 1 мин, степень извлечения астаксантина составила всего 28,4%. Lu Baoju et al. [18] извлекли астаксантин с помощью высокотемпературного кислотного метода мокрого нагрева при давлении насыщенного пара 0,1 МПа (121 ℃), концентрации соляной кислоты 0,5 моль/л, соотношении жидкости и сырья 30:1 (л:г), времени отбивания стенок 2 мин, степень извлечения составила 84,8% ± 3,2%. JIANG et al. [19] использовали соляную кислоту для обработки ферментированных дрожжевых клеток и получили 253,1 мг/л астаксантина. DA FONSECA et al. [20] использовали щелочные реагенты, такие как Na2CO3, для разрушения стенок дрожжей красной фифы, но обнаружили, что эффект был очень незначительным.

 

1.3 Биобрекчинг

Биологическое разрушение стенок - это в основном ферментативный метод, который является мягким и не наносит вреда человеку и окружающей среде, но все еще существует проблема выбора фермента и его переработки. Некоторые исследователи использовали лизин, произведенный Bacillus circulans A1.383-2, для разрушения стенки дрожжей красной фифы, и степень извлечения астаксантина достигла 98 % за 16,5 ч при температуре гидролиза 37 ℃, pH 5 и добавлении 33 мл лизина (1 603,8 Ед/г сухих дрожжей)[21] . Харит и другие [22] использовали акселеразу (Accellerase 1500) и глюканазу (Glucanex) для экстракции астаксантина и обнаружили, что скорость экстракции глюканазы была выше, чем у акселеразы. Затем они использовали центральный комбинированный дизайн для оптимизации условий разрушения стенок декстраназой и, наконец, обнаружили, что декстраназа при температуре 30,9 ℃, рН 4,5, степень извлечения астаксантина достигает 94%.

 

В целом, каждый метод дробления красных дрожжей имеет свои преимущества и недостатки, и существуют различия в местах, где он может быть использован. При дроблении красных дрожжей важно учитывать стоимость и эффективность, а также выбирать метод, который подходит для последующей промышленности. Физическое разрушение отвечает требованиям устойчивости и низкой стоимости и может лучше соответствовать требованиям промышленного массового разрушения, которое, как предполагается, станет будущим направлением промышленного извлечения астаксантина. Различные методы разрушения стенок и их состояние показаны в таблице 1.

 

2 Экстракция астаксантина из дрожжей красной фифы

Существует две основные категории методов экстракции астаксантина: (1) твердожидкостная экстракция астаксантина с использованием летучих органических реагентов; (2) экстракция с использованием новых зеленых реагентов или новых методов.

 

2.1 Экстракция обычными реагентами ЛОС

Распространенным методом экстракции астаксантина является метод органических растворителей, т.е. экстракция астаксантина с помощью обычных летучих органических реагентов. Обычные летучие органические растворители обычно представляют собой полярные реагенты, такие как метанол, этанол, ацетон, диметилсульфоксид и т.д., иногда могут использоваться и неполярные реагенты, такие как гексан. ZHANG et al. [23] использовали ацетон в качестве растворителя и твердожидкостную экстракцию для извлечения астаксантина из дрожжей красной фифы, и количество извлеченного астаксантина достигло 14,7 мг/л после встряхивания в течение 30 минут при 5 ℃. BATGHARE et al. [24] предсказали количество астаксантина, извлеченного из диметилсульфоксида:ацетона (1:2) с помощью метода UNIFAC, и проверили количество извлеченного астаксантина в условиях дрожжей красной фифы с помощью экспериментов. Количество астаксантина, извлеченного из дрожжей красной фифы в этих условиях, составило 1,57 г/л, что соответствовало прогнозу.

 

Некоторые ученые [25] использовали для экстракции астаксантина композитную систему ацетона и метанола, и количество экстрагированного астаксантина составило 4,70 мг/г. ZHANG et al. [26] встряхивали композитную ферментационную систему ацетона (ацетон ∶ ферментационный бульон =1:1) в течение 1 мин, и количество экстрагированного в этих условиях астаксантина составило 19,465 мг/л. Однако эти полярные или неполярные реагенты, используемые для экстракции астаксантина, могут нанести определенный ущерб здоровью человека, а неправильная утилизация может также загрязнить окружающую среду. Однако эти полярные или неполярные реагенты, используемые в процессе экстракции астаксантина, могут нанести определенный вред здоровью человека, а неправильное обращение с ними также загрязняет окружающую среду. Поэтому необходимо строго придерживаться лабораторных требований и правил во время процесса, а после использования проводить дальнейшее удаление, чтобы гарантировать, что продукт астаксантина соответствует требованиям для использования в пищевых продуктах или лекарствах.

 

2.2 Новая зеленая экстракция растворителем

В последние годы для экстракции астаксантина используются биорастворители и "зеленые" растворители с низким уровнем воздействия на окружающую среду и человека. Ионные жидкости являются новыми зелеными растворителями с низким содержанием или нетоксичными компонентами, которые не вредят окружающей среде и человеческому организму. MUSSAGY et al. [27] использовали различные холиновые ионные жидкости для экстракции астаксантина из дрожжей красной фифы и обнаружили, что холина каприлат является наиболее мощной ионной жидкостью для экстракции. Холин октаноат:вода = 1:1 (v/v), температура экстракции 45 ℃ и время экстракции 60 минут привели к степени извлечения астаксантина 85%. MUSSAGY et al. [28] проверили смесь растворителей (этанол:лауриновая кислота) с сильной способностью извлечения астаксантина с помощью модели COSMO-AC, и антиоксидантная способность астаксантина, извлеченного из этой смеси растворителей, была выше, чем у традиционного астаксантина дрожжей красной фифы. Антиоксидантная способность астаксантина, выделенного из этой смеси растворителей, была выше, чем у традиционного астаксантина дрожжей красной фифы. Использование каприлового/капринового триглицерида (GTCC) в качестве экстрагента позволило извлечь 539,4 мг/л астаксантина и успешно получить готовый продукт астаксантин-каприловый/каприновый триглицерид [29].

 

В дополнение к традиционным растворителям сверхкритические флюиды предлагают новый подход к экстракции астаксантина из дрожжей красной фифы. Сверхкритические жидкости не являются ни жидкостями, ни газами, но обладают хорошей текучестью и управляемостью, а также свойствами, которых нет у традиционных растворителей. Харит и др. [22] использовали комбинацию сверхкритического CO2 и этанола в качестве биостойкого растворителя для извлечения астаксантина, и степень извлечения астаксантина составила 22 % при 76,8 ℃, 360 бар и 18 % v/v этанола.

 

В последние годы разрабатывается все больше методов экстракции астаксантина из дрожжей красной фифы. Экстракция растворителями (полярными и неполярными) больше подходит для быстрого извлечения в лабораторных условиях из-за простоты использования. Использование "зеленых" растворителей или их комбинации с другими вспомогательными методами в большей степени соответствует концепции устойчивого развития, отвечает национальным требованиям безвредности для организма человека и окружающей среды и подходит для широкомасштабного продвижения. В настоящее время не существует единого метода извлечения астаксантина из дрожжей Red Fife, и в зависимости от требований используются различные методы. Соответствующие методы экстракции и их статус показаны в таблице 2.

 

3 Перспектива

По сравнению с химически синтезированным астаксантином, натуральный астаксантин более биосовместим и лучше выполняет свои антиоксидантные, противовоспалительные, антивозрастные и противораковые функции. Себестоимость производства натурального астаксантина высока, а процесс дробления клеток и извлечения астаксантина еще не отработан, поэтому цена продукта остается высокой.

 

В последние годы появление новых методов разрушения стенок подтолкнуло прогресс в исследовании натурального астаксантина для пищевых и медицинских целей, который может достичь высокой скорости разрушения стенок без использования летучих органических реагентов для обеспечения экологичности и нетоксичности процесса разрушения клеточных стенок. По сравнению с двумя другими методами, физическое разрушение клеточной стенки - это простой, легкий и недорогой процесс, который является будущим направлением разрушения клеточной стенки. С появлением новых зеленых растворителей процесс экстракции натуральных продуктов также достиг определенного прогресса, и способствовал развитию процесса зеленой экстракции астаксантина из дрожжей Red Fife, а использование новых зеленых растворителей соответствует требованиям зеленой химии, а также направлению будущего развития.

 

В настоящее время процесс дробления и экстракции натурального астаксантина из красных дрожжей все еще нестабилен, и мы должны продолжать наши усилия, чтобы преодолеть узкие места в процессе разрушения клеточной стенки красных дрожжей и экстракции астаксантина, чтобы способствовать развитию всей промышленности по производству астаксантина из красных дрожжей.

 

Ссылки:

[1] MUSSAGY C U,PEREIRA J F B,DUFOSSÉ L,et al.Advances and trends in biotechnological production of natural astaxanthin by Phaffia rhodozymayeast[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2023, 63(13):1862-1876.

[2] MISAWA N,SATOMI Y,KONDO K,et al.Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the genetic level[J].J Bacteriol,1995,177(22:65-65-65) предложенного на генном уровне[J].J Bacteriol, 1995, 177(22):6575-6584.

[3] NISHIDA Y,NAWAZ A,HECHT K,et al.Astaxanthin as a novel mitochondrial regulator:a new aspect of carotenoids,beyond antioxidants[J]. 2021,14(1):107

[4] Yao Kangfei , Zhang Ruilian , Liu Xiaojuan , et al. Исследование антилипидной перекисной активности астаксантина с различными стереоконформациями [J]. Chinese Journal of Food, 2018, 18(10):86-94.

[5] Meng Aung . Получение, стабильность и функциональность кристаллов астаксантина из Rhodococcus rainieri

Исследования [D]. Цзинань : Цзинаньский университет, 2020.

[6] MUSSAGY C U,REMONATTO D,PAULA A V,et al.Selective recovery and purification of carotenoids and fatty acids from Rhodotorula glutinis using Смеси биорастворителей[J].Separation and Purification Technology, 2021, 266:118548.

[7] GONG Z K, WANG H L, TANG J L, et al.Coordinated expression of astaxanthin biosynthesis genes for improved astaxanthin production in Escherichia coli[. J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(50): 14917-14927.

[8] GVR.Astaxanthin market size, share & trends analysis report by product (oil, softgel, liquid), by source (natural, synthetic), by application (aquaculture & animal feed, nutraceuticals), by region, and segment forecasts, 2024-2030[R].San Francisco:Grand View Research,2323. (аквакультура и корма для животных, нутрицевтики), по регионам, и прогнозы по сегментам, 2024-2030[R].Сан-Франциско:Grand View Research,2023.

[9] DEBNATH T, BANDYOPADHYAY T K, VANITHAK, et.al. Astaxanthin from microalgae: a review on structure, biosynthesis, production strategies and Применение[J].Food Res Int, 2024(176):113841.

[10] NAGAL S, RAJA A, ADIN S N, et al. Скрининг и разработка обогащенных β-каротином клеток Phaffia rhodozyma с помощью инженерии культурной среды[J]. Microbiology,2023,92:36-46.

[11] MUHAMMAD G,ALAMA,XIONG WL,et al.Microalgae biomass production:an overview of dynamic operational methods[J].Microalgae Biotechnology for Food, Health and High Value Products, 2020, 169:415-432.

[12] LIBKIND D,MOLINÉ M,COLABELLA F.Isolation and selection of new astaxanthin-producing strains of Phaffia rhodozyma[J].Methods Mol Biol, 2018,. 1852:297-310.

[13] GOGATE P R,NADAR S G.Ultrasound-assisted intensification of extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma[J].Indian Chemical Engineer, 2015,57(3/4):240-255.

[14] HASAN M, AZHAR M, NANGIA H, et al. Влияние гомогенизации под высоким давлением, ультразвука и сверхкритического флюида на экстракцию свободного астаксантина из клеток Phaffia rhodozyma, обработанных β-глюканазой[J]. из клеток Phaffia rhodozyma, обработанных β-глюканазой[J].Prep Biochem Biotechnol, 2016, 46(2):116-122.

[15] STEFANYSHYN O,HUNCHAK A,STARCHEVSKY V,et al. Разрушение дрожжевых клеток xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) с помощью вибрации резонансным низкочастотным кавитатором[J].Химия и химическая технология, 2023, 17(1):188-194.

[16] CHEN L, WANG J L, NI H, et al. Disruption of Phaffia rhodozyma cells and preparation of microencapsulated astaxanthin with high water solubility[J]. Food Sci Biotechnol, 2018, 28(1):111-120.

[17] SILVA P G P, JÚNIOR D P, DE MEDEIROS BURKERT J F, et al. Экстракция каротиноидов из биомассы Phaffia rhodozyma: стратегии переработки и экономическая оценка энергии[J].Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2023, 40:93-102.

[18] LU Baoju , XIAO Anfeng , LI Lijun , et al. Экстракция внутриклеточного астаксантина из дрожжей Fife с помощью высокотемпературного, влажно-теплового и кислотного разрушения [J]. Журнал биоинженерии, 2008(7):1285-1292.

[19] JIANG G L, ZHOU L Y, WANG Y T, et al. Astaxanthin from Jerusalem artichoke: production by fed-batch fermentation using Phaffia rhodozyma and применение в косметике[J].Process Biochemistry, 2017, 63:16-25.

[20] DA FONSECA R A S, RAFAEL R, KALIL S J, et al. Различные методы разрушения клеток для извлечения астаксантина из Phaffia rhodozyma [J].

Африканский журнал биотехнологии, 2011, 10(7):1165-1171.

[21] JIAN H L,SONG G J.Study on hydrolysis of yeast-wall with lytic enzyme for extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma[J]. Прикладная механика и материалы, 2014, 651/653:297-300.

[22] HARITH Z T, DE ANDRADE LIMA M, CHARALAMPOPOULOS D, et al.

al.Оптимизированное производство и экстракция астаксантина из дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous[J].Микроорганизмы, 2020, 8(3):430.

[23] ZHANG J,LI Q R,LIU J H,et al.Astaxanthin overproduction and proteomic analysis of Phaffia rhodozyma under the oxidative stress induced by TiO2[J]. Bioresour Technol,2020,311:123525.

[24] BATGHARE A H, PATI S, ROY K, et al. Mechanistic investigations in ultrasound-assisted extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma MTCC 7536[J ].Bioresource Technology Reports, 2018, 4:166-173.

[25] GUAN X Y, ZHANG J, XU N, et al. Optimisation of culture medium and scale-up production of astaxanthin using corn steep liquor as substrate by response surface methodology [J]. методом поверхности отклика[J].Prep Biochem Biotechnol, 2023, 53(4):443-453.

[26] ZHANG C, ZHAO X H, YAO M J, et al. Высокоплотное культивирование Phaffia rhodozyma SFAS-TZ08 в соке сладкого картофеля для производства астаксантина[J]. Электронный журнал биотехнологии, 2023, 61:1-8.

[27] MUSSAGY C U,FARIAS F O,BILA N M,et al.Восстановление β-каротина и астаксантина из биомассы Phaffia rhodozyma с помощью водных растворов ионных жидкостей на основе холиния[J].Separation Technology, 2022, 290:852. на основе ионных жидкостей[J].Separation and Purification Technology, 2022, 290:120852.

[28] MUSSAGY C U, FARIAS F O, SANTOS-EBINUMA V C, et al. Устойчивая платформа one-pot для зеленого восстановления каротиноидов из дрожжей Phaffia rhodozyma и их использования в качестве натуральных добавок в рецептуре мыла[J].Environmental Technology & Innovation, 2023, 29:103029.

[29] CHENG X Y,XIONG Y J,YANG M M,et al.Preparation of astaxanthin mask from Phaffia rhodozyma and its evaluation[J].Separation and Purification Technology,2019,290:195-202.