Могут ли наночастицы хитозана ⁃ астаксантина облегчить колиты у мышей?

 Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) - это хроническое заболевание кишечника, клинические проявления которого включают боли в животе, диарею, ректальные кровотечения и потерю массы тела, что серьезно влияет на нормальную жизнь пациентов[1] . В настоящее время лечение IBD по-прежнему основано на традиционных химических препаратах, таких как аминосалициловая кислота и кортикостероиды, которые часто не могут достичь полного излечения, и пациенты часто нуждаются в пожизненном лечении[2] . Поэтому важно найти новый способ облегчить симптомы пациентов и повысить безопасность и эффективность использования лекарств для лечения IBD.

 

Астаксантин (АСТ), т.е. 3,3'⁃дигидрокси-β,β'⁃каротин-4,4'⁃дион, является жирорастворимым каротиноидом с различными биологическими свойствами, такими как антивозрастная, противовоспалительная, антиоксидантная и противораковая активность[3] . Было показано, что АСТ может быть использован в качестве терапевтического средства при воспалительных заболеваниях кишечника[4], но высокая ненасыщенность структуры АСТ делает его легко разлагающимся под действием света и тепла[5], поэтому применение АСТ очень ограничено. В последние годы было обнаружено, что инкапсуляция АСТ в наночастицы может эффективно улучшить стабильность и биодоступность АСТ. Однако подобные наночастицы обладают такими недостатками, как плохая стабильность при хранении и низкая скорость инкапсуляции, поэтому необходимо найти носители, способные улучшить стабильность АСТ и добиться адресной доставки лекарств.

 

Хитозан (CS) - это природный полимер, обладающий биоразлагаемостью, биосовместимостью и биобезопасностью[6] . Поэтому разработка CS в качестве материала для доставки активных веществ стала актуальной темой исследований в области пищевой промышленности и медицины. Было показано, что комплексообразование CS с липосомами может улучшить электростатическое взаимодействие липосом и усилить антиоксидантную активность липосом[7] , а покрытие CS может уменьшить скорость потока через мембрану липосом, тем самым обеспечивая медленное высвобождение лекарств[8] . Таким образом, использование CS в качестве материала внешнего покрытия для липосом имеет хороший потенциал в области доставки лекарств.

 

В данном исследовании хитозан ⁃ модифицированный астаксантином⁃ нагруженные наночастицы (CS-AST⁃NPs) были приготовлены путем нанесения CS на поверхность AST-нагруженных липосом и увеличения количества AST, инкапсулированного на поверхности липосом, на основе предыдущего исследования [9]. Наночастицы характеризовали по размеру частиц, дзета-потенциалу, скорости инкапсуляции и ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье, а стабильность и высвобождение лекарств из наночастиц оценивали по стабильности при хранении и в тестах по моделированию выведения in vitro. На мышиной модели колита с использованием натриевой соли сульфата декстрана (DSS) исследовали мелиоративное действие CS⁃AST⁃NPs на колит у мышей с целью разработки систем нанодоставки AST для облегчения колита и предоставления новых идей для лечения колита.

 

1 Материалы и методы

1.1 Лабораторные животные

Самцы мышей C57BL/6: компания Viton Lihua Laboratory Animal Technology Limited, лицензия на производство животных № SCXK (Пекин) 2019 ⁃0008.

 

1.2 Материалы и реагенты

Астаксантин (чистота >90%), хитозан (деацетилирование >85%), соевый лецитин, холестерин, 1,1 ⁃дифенил ⁃2 ⁃ тринитрофенилгидразин (1,1 ⁃ди ⁃ фенил ⁃ 2 ⁃ пикрилгидразил, DPPH) (все аналитически чистые): Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co. Ltd.; тест-набор для определения фактора некроза опухоли ⁃α (TNF ⁃α), тест-набор для определения интерлейкина, ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) и другие наборы для анализа. Ltd.; наборы для определения SOD (супероксиддисмутазы) и GSH (глутатиона): Нанкинский институт биоинженерии им. Цзяньцзяня; набор для определения малонового диальдегида (MDA): Нанкинский институт биоинженерии им. Ltd.; петролейный эфир (30~60 ℃), трихлорметан (все аналитически чистые): Chengdu Cologne Chemical Co.

 

1.3 Инструменты и оборудование

Ротационный испаритель (модель N ⁃ 1100D ⁃ WD): EYELA, Япония; анализатор слежения за наночастицами (модель NanoSight NS300): Malvern Panacor; инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (модель LUMOS): Bruker, Германия; ультрафиолетовый спектрофотометр видимого диапазона (модель UV ⁃ 1800): Shimadzu Instruments Suzhou, Китай; гомогенизатор высокого давления (модель AH100B): ATS Industrial Systems Canada Ltd. Ltd.; Гомогенизатор высокого давления (модель AH100B): ATS Industrial Systems Ltd., Канада; Камера (Nikon Digi⁃ tal Sight DS⁃U3): Nikon, Япония; Цифровой высокоскоростной диспергирующий гомогенизатор (модель FJ200 ⁃ SH): Shanghai HUANYAI Industrial Co.

 

1.4 Методология

1.4.1 Приготовление наночастиц CS

Методика Gu et al [10] была использована с соответствующими изменениями. Модифицированные хитозаном наночастицы, нагруженные астаксантином (CS⁃AST⁃NPs), были приготовлены методом тонкопленочной гидратации ⁃ гомогенизации под высоким давлением. Соевый лецитин, холестерин и AST растворяли в хлороформе в массовом соотношении 10:2:1, затем органический растворитель удаляли ротационным выпариванием при 30 ℃ в течение 30 мин, чтобы получить тонкую липидную мембрану. Добавьте 10 мл 0,05 моль/л фосфатного забуференного солевого раствора (PBS) с рН 7,4, хорошо перемешайте и выдержите при температуре 55 ℃ в течение 2 ч. Гидратируйте липосомы, нагруженные АСТ. Липосомы гидратировали для получения липосом, нагруженных AST. 1,5 мг/мл раствора CS готовили и смешивали с наночастицами, нагруженными AST, в равном объеме при непрерывном перемешивании при 1000 об/мин в течение 4 ч. Затем липосомы подвергали высокоскоростному сдвигу и гомогенизации под высоким давлением при 150 МПа в течение 5 циклов с использованием цифрового высокоскоростного диспергирующего гомогенизатора для получения CS ⁃ AST ⁃ NPs.

 

1.4.2 Измерение среднего размера частиц, индекса полидисперсности (PDI) и дзета-потенциала

Перед измерением свежеприготовленные наночастицы разбавляли соответствующим образом и измеряли размер частиц, PDI и дзета-потенциал CS⁃AST⁃NPs с помощью анализатора слежения за наночастицами.

 

1.4.3 Измерение эффективности инкапсуляции (EE) и нагрузочной способности (LC)

Для определения эффективности инкапсуляции (EE) и способности наночастиц к загрузке лекарственными средствами (LC) использовался метод центробежной экстракции. 1 мл CS⁃AST⁃NPs перемешивали с 5 мл петролейного эфира в течение 5 минут, затем смесь центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 5 минут, и органическую фазу собирали как экстракт AST. Абсорбцию экстракта измеряли при 490 нм и рассчитывали скорость включения (Y1, %) и нагрузку препарата (Y2, %) по следующей формуле.

 

1.4.4 Измерение FT⁃IR

Фурье-спектроскопию (FT⁃transform infrared spectroscopy, FT⁃IR) проводили по методу Santos et al [11]. Образцы соединяли с бромистым калием в массовом соотношении 1:100 до образования однородного порошка, который затем прессовали в прозрачный лист и подвергали ИК-Фурье спектроскопии в диапазоне длин волн 500-4 000 см-1 .

 

1.4.5 Определение стабильности при хранении

Свежеприготовленные образцы были запечатаны в коричневые стеклянные флаконы и хранились при 4 °C в течение 7 дней. Стабильность наночастиц оценивалась путем измерения размера частиц хранившихся наночастиц.

 

1.4.6 Моделирование пищеварения in vitro

Согласно методу Wang et al [12] с соответствующими изменениями, 10 мл образца смешивали с имитацией желудочной жидкости (SGF) в равном объеме при 37 ℃, доводили значение pH до 2 и перемешивали в течение 2 ч. Затем значение pH доводили до 7, и к образцу добавляли предварительно нагретую имитацию желудочной жидкости (SGF). Значение pH было отрегулировано до 7, и к образцу была добавлена подогретая симулированная внутрижелудочная жидкость (SIF).  Реакцию проводили методом УФ-видимой спектрофотометрии. Поглощение различных переваренных образцов при 490 нм измеряли методом ультрафиолетовой/видимой спектроскопии (UV/Vis) в указанный момент времени, и кумулятивную скорость высвобождения АСТ из CS ⁃ AST ⁃ NPs рассчитывали по следующей формуле (W1, %).1.4.7 Дизайн эксперимента на животных

 

1.4.7.1 Группировка и моделирование экспериментов на животных

В соответствии с методом Чена и других [13] с соответствующими изменениями были отобраны неспецифические патогенные самцы мышей C57BL/6 (8~10 недель) и использовали 4% DSS для вызывания колита с целью изучения мелиоративного эффекта наночастиц на колит у мышей. После 3 дней акклиматизации мышей разделили на 5 групп по 6 мышей в каждой: нормальные, модельные, носители, AST и CS⁃AST⁃NPs. Мыши подвергались моделированию колита в соответствии с графиком, представленным на рисунке 1, т.е. после 3 дней акклиматизационного кормления мышам в группах Carrier, AST и CS⁃AST⁃NPs давали пустые носители [20 г/кг-сут], AST и CS⁃AST⁃ NPs, соответственно [доза AST составляла 1 г/кг-сут]. Через 7 дней мышам всех групп, кроме группы "Норма", давали 4% DSS в воде в течение 7 дней, чтобы вызвать колит. На 14-й день мышей постили, на 15-й - умерщвляли путем декапитации, после чего у них собирали сыворотку и ткани толстой кишки. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике лабораторных животных (номер одобрения IRM ⁃DWLL ⁃2022016). Процедура DSS-индуцированного острого колита у мышей показана на рисунке 1.

 

1.4.7.2 Измерение индекса активности заболевания (DAI)

В течение периода моделирования мышей оценивали по снижению массы тела, наличию фекальных кровотечений и фекальной слизи, т.е. по индексу активности болезни (DAI), в соответствии с критериями оценки Cai et al [14].

 

1.4.7.3 Анализ инфильтрации толстой кишки купроцитами и воспалительными клетками

Вырезанные ткани толстой кишки фиксировали в 4% параформальдегиде и затем помещали в парафин. Чашевидные клетки окрашивали периодическим раствором кислоты Шиффа (PAS), воспалительный клеточный инфильтрат толстой кишки наблюдали после окрашивания антимышиным F4/80 или антимышиным Ly6G антителом, а изображения срезов фиксировали с помощью камеры.

 

1.4.7.4 Измерение уровня факторов воспаления и показателей окислительного стресса в тканях толстой кишки

Уровень воспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли ⁃α, интерлейкина ⁃ 1β (IL ⁃ 1β), интерлейкина ⁃ 6 (IL ⁃ 6), глутатиона и супероксиддисмутазы - определяли в сыворотке крови в соответствии с инструкцией к набору.

 

1.5 Обработка и анализ данных

Данные из каждой группы анализировали не менее трех раз, результаты представляли как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism 8 с использованием непарных t-тестов с двумя хвостами.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Подготовка и характеристика наночастиц

2.1.1 Средний размер частиц, PDI и дзета-потенциал CS⁃AST⁃NPs Визуализация и распределение размеров CS⁃AST⁃NPs показаны на рисунке 2.

Как показано на рис. 2, размер частиц липосом астаксантина, покрытых CS, был сосредоточен на 36,0 нм, и не наблюдалось очевидной агрегации или флокуляции наночастиц. PDI CS⁃AST⁃NPs составил 0,242±0,091, что указывает на то, что наночастицы имели более узкое распределение размеров частиц и были равномерно распределены в гранулометрическом составе. Кроме того, чем выше абсолютное значение заряда липосом, тем выше их стабильность[15] . Кроме того, чем больше абсолютное значение заряда липосомы, тем выше ее стабильность[15] . Дзета-потенциал CS⁃AST⁃NPs составил (30,77±0,78) мВ, что указывает на высокую стабильность системы, что согласуется с данными отчета Bai et al[16] . В заключение следует отметить, что CS⁃AST⁃NPs имеют равномерное распределение частиц по размерам, хорошую дисперсию и стабильность.

 

2.1.2 Анализы LC и EE

Скорость инкапсуляции и загрузка лекарственного средства CS⁃AST⁃NPs показаны на рисунке 3.

Как показано на рис. 3, после покрытия нанолипосом CS EE АСТ достигла 91,91%, а LC АСТ в наночастицах также достигла 7,05%. Это может быть связано с тем, что покрытие, образованное CS, ингибировало утечку АСТ и, таким образом, улучшало стабильность АСТ в липидной фазе [17].

 

2.1.3 Спектральный анализ FT⁃IR

FT ⁃ ИК-профили CS, AST ⁃ NPs и CS ⁃ AST ⁃ NPs показаны на рис. 4.

Как показано на рис. 4, характерные пики спектра CS при 3 428,64 см-1 относятся к растягивающим колебаниям O-H и N-H групп [15], а характерные пики при 1 658,69, 1 596,65 см-1 и 1 150,36 см-1 относятся к C -O растягивающим колебаниям в амиде I и N-H изгибающим колебаниям в амиде II[18] . Сравнивая ИК-Фурье спектры CS, AST⁃NPs и CS⁃AST⁃NPs, можно заметить, что два характерных пика CS⁃AST⁃NPs (1 628,36 см-1 и 1 144,78 см-1), которые отсутствуют в AST⁃NPs, присутствуют в CS (1 658,69 см-1 и 1 150,36 см-1), что доказывает успешное покрытие CS на AST липидах. N-H CS ⁃AST ⁃NPs переместился с 1 150,36 см-1 на 1 144,78 см-1 , что может быть связано со сшивкой CS и AST ⁃NPs посредством электростатических взаимодействий. Спектры AST⁃NPs показали, что симметричные и антисимметричные растягивающие колебания CH2 существовали при 2 925,90 см-1 и 2 857,27 см-1 , которые не изменились после нанесения CS, что говорит о том, что AST липосомы внутри наночастиц не изменились из-за покрытия CS[19] . В заключение следует отметить, что CS был успешно нанесен на поверхность липосом AST.

 

2.1.4 Анализ стабильности хранения

В данном исследовании стабильность CS⁃AST⁃NPs оценивалась после 7 дней хранения при 4 °C. Размеры частиц групп носителя и CS⁃AST⁃NPs после 7 дней хранения при 4 °C показаны на рис. 5.

Из рис. 5 видно, что размеры частиц как группы носителей, так и группы наночастиц незначительно увеличились после 7 дней хранения: с 32,45 нм до 37,28 нм для группы носителей и с 36,08 нм до 42,45 нм для группы CS ⁃ AST ⁃ NPs, в то время как размеры частиц группы носителей и группы наночастиц были менее 50 нм после 7 дней хранения. Небольшое увеличение размера частиц наночастиц во время хранения является приемлемым, что может быть связано с некоторой агрегацией или разрушением липосом во время хранения[20] . В заключение следует отметить, что стабильность CS⁃AST⁃NPs, нагруженных высокими дозами AST, была хорошей в течение 7 дней хранения.

 

2.1.5 Свойства высвобождения наночастиц при пищеварении in vitro

На рисунке 6 показаны профили высвобождения AST и CS⁃AST⁃NPs в моделируемой желудочной жидкости (SGF) и моделируемой кишечной жидкости (SIF) при 37 ℃.

Как показано на рис. 6, скорость высвобождения свободного АСТ в SGF составляла всего 1,69%, что может быть связано с низкой растворимостью и биодоступностью АСТ[21] . После инкапсуляции АСТ в наночастицы и имитации пищеварения в течение 2 ч скорость высвобождения CS-AST-NPs достигла 25,05%, что может быть связано с тем, что покрытие CS повышает стабильность наночастиц в желудочной среде и защищает внутренний слой липосом, что снижает высвобождение АСТ в SGF[22] . Кумулятивная скорость высвобождения CS ⁃AST ⁃ NPs постепенно увеличивалась с увеличением времени инкубации в СКФ, достигнув 66,70% через 24 ч. Это согласуется с данными Chen et al[23] . Это совпадает с результатами Chen et al[23] . Кроме того, взаимодействие между положительно заряженной поверхностью CS и отрицательно заряженным слоем кишечной слизи усиливало адгезию CS в кишечнике, тем самым продлевая время его удержания в кишечнике[24] . В заключение следует отметить, что покрытия CS могут формировать защитную оболочку на поверхности липосом, предотвращая преждевременное высвобождение лекарств, и обладают определенными кишечными таргетными свойствами.

 

2.2 Интервенционное воздействие наночастиц на мышей с колитом

2.2.1 Влияние CS⁃AST⁃NPs на массу тела мышей с колитом

Скорость изменения массы тела мышей в разных группах лечения и величина изменения массы тела мышей на 14-й день показаны на рис. 7.

Как видно на рисунке 7, исходная масса тела в каждой группе существенно не отличалась, масса тела мышей в группе "Норма" постепенно увеличивалась, тогда как масса тела мышей в группе "Модель", группе "Носитель", группе "АСТ" и группе "CS⁃AST⁃NPs" начала снижаться на 11-й день. Через 14 дней непрерывного кормления масса тела мышей в модельной группе снизилась на 22,08 % по сравнению с исходной массой тела, что свидетельствует о том, что язвенный колит, вызванный DSS, привел к снижению массы тела мышей, что согласуется с результатами исследования Tie et al[1] . Кроме того, масса тела мышей в группе АСТ снизилась на 18,24% по сравнению с исходной массой тела, тогда как масса тела мышей, обработанных CS-AST-NPs, снизилась только на 15,63%, что указывает на то, что АСТ может эффективно улучшить снижение массы тела у мышей, а инкапсулированный в наночастицы АСТ может иметь лучший эффект улучшения. В заключение следует отметить, что CS-AST-NPs могут значительно улучшить снижение массы тела у мышей с язвенным колитом, вызванным DSS.

 

2.2.2 Влияние CS ⁃ AST ⁃ NPs на индекс активности заболевания у мышей с колитом

Изменения показателей DAI в различных группах лечения и показатели DAI у мышей на 14-й день показаны на рисунке 8.

Как показано на рисунке 8, по сравнению с группой нормы, ПДР мышей в группах модели, носителя, АСТ и CS⁃AST⁃NPs увеличивался. На 14-й день индекс DAI в группе Model (9,8) был значительно выше, чем в группе Nor⁃ mal (0,2) (P<0,001), что свидетельствует об успешности модели острого колита. Более низкий показатель DAI (7) в группе CS-AST ⁃ NPsx по сравнению с группами Carrier и AST позволяет предположить, что CS-AST ⁃ NPs более эффективны в облегчении колита. Покрытие CS может предотвратить преждевременное высвобождение препарата из желудка и тонкой кишки и специфически высвободить препарат в толстой кишке для смягчения последствий колита.

 

2.2.3 Влияние CS⁃AST⁃NPs на длину толстой кишки у мышей с колитом  

Фотографии тканей толстой кишки и длины толстой кишки в разных группах показаны на рисунке 9.

Как показано на рисунке 9a, ткань толстой кишки в группе нормы была однородной и гладкой, в то время как ткань толстой кишки в группе модели имела явную оккультную кровь и укорочение. После вмешательства AST и CS ⁃AST⁃NPs кровотечение в ткани толстой кишки мышей уменьшилось, а длина толстой кишки значительно восстановилась. Как видно на рис. 9b, длина толстой кишки в группе модели была на 2,42 см короче, чем в группе нормы (P<0,001), а вмешательство АСТ и CS ⁃ AST ⁃ NPs эффективно подавляло укорочение ткани толстой кишки. Длина толстой кишки в группах AST и CS ⁃ AST ⁃ NPs достигла 4,22 см и 4,74 см, соответственно, что было выше, чем в группе модели, что может быть связано с антиоксидантной и противовоспалительной активностью AST, которая может облегчить язвенный колит у мышей[25] . Однако из-за плохой растворимости в воде и стабильности АСТ желудочная кислота и сложная ферментная среда могут снизить его биодоступность[5] . Поэтому группа АСТ имела меньший эффект на восстановление длины толстой кишки, чем группа CS⁃AST⁃NPs (P<0,01), что совпадает с результатами исследования Tao et al[26] . В заключение следует отметить, что липосомы АСТ, покрытые CS, могут эффективно улучшать укорочение толстой кишки, вызванное язвенным колитом.

 

2.2.4 Влияние CS⁃AST⁃NPs на гистопатологию толстой кишки

Окрашивание гематоксилином ⁃ эозином (HE) тканей толстой кишки различных групп лечения и глубина крипт у мышей показаны на рисунке 10.

Как видно на рисунке 10, толстая кишка в группе нормы была структурно неповрежденной, без явных гистопатологических повреждений, а крипты были структурно неповрежденными без явной воспалительной клеточной инфильтрации, тогда как в группе модели, вызванной DSS, наблюдались явные патологические повреждения. Результаты окрашивания HE показали, что вмешательство AST и CS⁃AST⁃NPs улучшило патологические повреждения толстой кишки, а гистологическая структура группы CS⁃AST⁃NPs была даже близка к структуре нормальных мышей, что согласуется с результатами Tao et al[26]. Кроме того, статистический анализ глубины крипт дополнительно подтвердил терапевтический эффект CS⁃AST⁃NPs. По сравнению с модельной группой, глубина крипт у мышей, обработанных CS⁃AST⁃NPs, увеличилась, что говорит о значительном уменьшении повреждения структуры крипт (P<0,01). Эти результаты свидетельствуют о том, что CS-AST-NPs эффективно уменьшали гистопатологические повреждения, вызванные DSS в толстой кишке.

 

2.2.5 Влияние CS⁃AST⁃NPs на купроциты ткани толстой кишки

Толщина эпителиальных клеток толстой кишки и апоптоз клеток чашечек могут быть оценены по PAS-окрашиванию тканей толстой кишки. Результаты окрашивания PAS тканей толстой кишки в разных группах лечения представлены на рисунке 11.

Как видно на рисунке 11, чашеобразные клетки в толстой кишке в группе нормы были круглыми и полными, в то время как в группе модели они были значительно уменьшены или сокращены. В группе AST и CS⁃AST⁃NPs количество чашеобразных клеток в ткани толстой кишки увеличилось по сравнению с модельной группой, размер клеток увеличился, и они были равномерно распределены в криптах, что еще раз доказывает, что CS⁃AST⁃NPs может эффективно увеличить количество чашеобразных клеток у мышей с колитом, и может поддерживать целостность кишечного барьера за счет секреции мукоидных белков чашеобразными клетками для эффективного облегчения колита, что согласуется с результатами гистологии толстой кишки. Это согласуется с результатами гистологического исследования толстой кишки.

 

2.2.6 Влияние CS⁃AST⁃NPs на инфильтрацию воспалительных клеток в ткани толстой кишки    

Иммуногистохимическое окрашивание тканей кишечника F4/80 и Ly6G представлено на рисунке 12.

Как показано на рисунке 12, в соответствии с предыдущими результатами, нейтрофилы и макрофаги были значительно увеличены в тканях колита в группе моделирования по сравнению с группой "Nor", что свидетельствует о наличии тяжелой воспалительной реакции в тканях толстой кишки[27] . Вмешательство AST и CS⁃AST⁃NPs ингибировало инфильтрацию макрофагов и нейтрофилов, что оказалось эффективным в подавлении повреждения кишечного барьера и поддержании иммунного барьера кишечного тракта[27] . Улучшение воспаления при вмешательстве CS⁃AST⁃NPs было еще более выраженным, что может быть связано с хорошей биодоступностью наночастиц и медленным высвобождением препаратов. Это может быть связано с хорошей биодоступностью наночастиц и медленным высвобождением лекарств. В заключение следует отметить, что CS⁃AST⁃NPs могут уменьшать колит у мышей за счет снижения инфильтрации макрофагов и нейтрофилов.

 

2.2.7 Влияние CS⁃AST⁃NPs на факторы воспаления в сыворотке крови у мышей с колитом

Сывороточные уровни факторов воспаления в разных группах лечения представлены на рисунке 13.

Как показано на рисунке 13, сывороточные уровни TNF ⁃α, IL ⁃6 и IL ⁃1β были значительно повышены в модельной группе по сравнению с группой Nor⁃ mal после индукции DSS (P<0,001). По сравнению с модельной группой, вмешательство АСТ и CS ⁃ АСТ ⁃ NPs подавляло экспрессию провоспалительных факторов, что может быть связано со способностью АСТ снижать регуляцию экспрессии факторов воспаления для уменьшения воспалительной реакции кишечника[28] . 84.42% (P<0.001). Возможно, наночастицы улучшили растворимость и биодоступность АСТ, а покрытие CS обеспечило барьер для наночастиц, что улучшило терапевтический эффект.

 

2.2.8 Влияние CS ⁃ AST ⁃ NPs на окислительное повреждение в толстой кишке мышей, страдающих колитом

Как показано на рисунке 14, уровни GSH и SOD в модельной группе снизились на 44,09% и 52,77%, соответственно, по сравнению с нормальной группой. По сравнению с группой нормы, уровни GSH и SOD в группе модели снизились на 44,09% и 52,77%, соответственно, что указывает на окислительное повреждение в тканях толстой кишки[29]. После вмешательства АСТ и CS⁃AST⁃NPs уровни GSH и SOD увеличились, и группа CS⁃AST⁃NPs смягчила повреждение от окислительного стресса более эффективно, чем группа АСТ. По сравнению с модельной группой, содержание GSH и активность СОД в группе CS⁃AST⁃NPs увеличились на 37,57% (P<0,05) и 42,61% (P<0,01), соответственно. CS⁃AST⁃NPs могут играть терапевтическую роль в лечении колита путем ослабления окислительного повреждения толстой кишки.

 

3 Заключение

В данном исследовании были успешно получены наночастицы AST, модифицированные CS, и исследовано их действие на язвенный колит у мышей, вызванный DSS. Результаты показали, что CS⁃AST⁃NPs обладают высокой степенью инкапсуляции, хорошей стабильностью при хранении и свойством медленного высвобождения астаксантина. Эксперименты на животных показали, что CS-AST-NPs могут значительно облегчить симптомы колита у мышей. Кроме того, CS⁃AST⁃NPs могут уменьшить инфильтрацию воспалительных клеток в толстой кишке и подавить секрецию провоспалительных факторов, тем самым уменьшая воспалительную реакцию толстой кишки и сохраняя структурную целостность кишечного тракта. Между тем, CS-AST-NPs обладают хорошей антиоксидантной активностью, которая может эффективно увеличить содержание GSH и активность SOD в тканях толстой кишки и уменьшить окислительное повреждение, индуцированное DSS. В заключение следует отметить, что АСТ может быть использован в качестве потенциального природного активного вещества для облегчения язвенного колита, а CS имеет перспективное применение в области доставки лекарств при энтерите.

 

Ссылки:

[1] TIE S S, SU W T, CHEN Y N, et al. Наночастицы процианидина с двойной направленностью действия и реакцией на глутатион для лечения колита[J]. Chemical Engineering Journal, 2022, 441: 136095.

[2] ELHAG D A, KUMAR M, SAADAOUI M, et al. Лечение воспалительных заболеваний кишечника и прогностические биомаркеры терапевтического ответа[J]. Международный журнал молекулярных наук, 2022, 23(13): 6966.

[3] EKPE L, INAKU K, EKPE V. Antioxidant effects of astaxanthin in various diseases-A review[J]. Journal of Molecular Pathophysiol⁃ ogy, 2018, 7(1): 1.

[4] WANG J T, CHEN Y Y, HAN L L, et al. Microenvironment respon⁃ sive pod⁃structured nanocarrier for ameliorating inflammatory bowel disease [J]. Chinese Chemical Letters, 2024, 35(7): 109029.

[5] ZHAO T, YAN X J, SUN L J, et al. Research progress on extrac⁃ tion, biological activities and delivery systems of natural astaxan⁃ thin[J]. Trends in Food Science & Technology, 2019, 91: 354⁃361.

[6] ESPOSTO B S, JAUREGI P, TAPIA ⁃ BLÁCIDO D R, et al. Lipo⁃ somes vs. chitosomes: Encapsulating food bioactives[J]. Trends in Food Science & Technology, 2021, 108: 40⁃48.

[7] LI Q Q, RAN C C, CHEN J Y, et al. Хитозан⁃ покрытые двойные⁃ загруженные липосомы как перспективная система доставки эфирного масла гвоздики[J]. Журнал пищевой инженерии, 2024, 376: 112084.

[8] JIAO Z, WANG X D, YIN Y T, et al. Preparation and evaluation of achitosan⁃coated antioxidant liposome containing vitamin C and fo⁃ licacid[J]. Journal of Microencapsulation, 2018, 35(3): 272⁃280.

[9] ZHANG X P, WU Z J, ZHANG W, et al. Модификация поверхности хитозаном для повышения стабильности и антиоксидативной активности астакса ⁃ антина ⁃, загруженных липосом [J]. LWT ⁃ Food Science and Technology, 2024, 198: 116033.

[10] GU L Y, JI S P, WU B, et al. Инкапсуляция астаксантина в нанокапсулу с помощью технологии гомогенизации под высоким давлением: исследование стабилизации, антиоксидантной активности и высвобождения in vitro[J]. Journal of Dispersion Science and Technology, 2024, 45(6): 1129⁃1140.

[11] SANTOS J, TRUJILLO⁃CAYADO L A, CARRELLO H, et al. Opti⁃ mization of sonication parameters to obtain food emulsions stabi⁃ lised by zein: Formation the зеин ⁃ диутановая камедь/зеин ⁃ гуаровая камедь ком⁃ плексы[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2022, 102(5): 2127⁃2134.

[12] WANG N, SHAO L Y, LU W J, et al. 5⁃aminosalicylic acid pH sen⁃ sitive core ⁃ shell nanoparticles targeting ulcerative colitis[J]. Jour⁃ nal of Drug Delivery Science and Technology, 2022, 74: 103578.

[13] CHEN Y N, SU W T, TIE S S, et al. Orally deliverable sequence ⁃ targeted astaxanthin nanoparticles for colitis alleviation [J]. Biomate⁃ rials, 2023, 293: 121976.

[14] CAI X R, WANG X L, HE M Y, et al. Colon⁃targeted delivery of ta⁃ crolimus using pH ⁃ responsive polymeric nanoparticles for murine colitis therapy [J].  International Journal of Pharmaceutics, 2021, 606: 120836.

[15] WANG W, HU J J, ZHANG R D, et al. Реагирующий на рН карбокси⁃ метилцеллюлоза/хитозан гидрогель для адсорбции и десорбции анионных и катионных красителей[J]. Целлюлоза, 2021, 28(2): 897⁃909.

[16] BAI X X, FENG Z A, PENG S, et al. Хитозан⁃модифицированный полисахарид Phellinus igniarius PLGA наночастицы ameliorated inflam ⁃ matory bowel disease [J].   Biomaterials Advances, 2022, 139: 213002.

[17] LIU A Y, CHAI X H, ZHU S, et al. Влияние покрытия N⁃succinyl ⁃chitosan на свойства астаксантина ⁃ загруженных PEG ⁃ липосом: экологическая стабильность антиоксидантной/антибактериальной активности и высвобождения in vitro[J].   International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 244: 125311.

[18] PAVONI J M F, LUCHESE C L, TESSARO I C. Влияние типа кислоты для растворения хитозана на характеристики и способность к биодеградации пленок на основе кукурузного крахмала/ пленок на основе кукурузного крахмала/хитозана[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 138: 693⁃703.

[19] RESZCZYŃSKA E, SUJAK A, GRUSZECKI W I, et al. Влияние рН и пальмитиновой кислоты на организацию и стабильность лютеина в фосфатидилхолиновых мембранах - спектроскопические исследования[J]. Jour⁃ nal of Molecular Liquids, 2023, 384: 122269.

[20] SEBAALY C, TRIFAN A, SIENIAWSKA E, et al. Влияние покрытия из хитозана на характеристики липосом: фокус на биоактивных соединениях и эфирных масел: обзор[J]. Processes, 2021, 9(3): 445.

[21] SORASITTHIYANUKARN F N, MUANGNOI C, ROJSITTHISAK P, et al. Хитозанолигосахарид/альгинатные наночастицы как эффективный носитель для астаксантина с улучшенной стабильностью, пероральной биодоступностью и биодоступностью in vitro[J].   Food Hydrocolloids, 2022, 124: 107246.

[22] MOHAMMADI M, HAMISHEHKAR H, MCCLEMENTS D J, et al. Инкапсуляция гидролизатов белка спирулины в липосомы: влияние на антиоксидантную активность и поведение в желудочно-кишечном тракте[J]. Пищевая химия, 2023, 400: 133973.

[23] CHEN S Q, SONG Y Q, WANG C, et al. Хитозан ⁃ модифицированная липидная система доставки нанопрепаратов для целевого и отзывчивого лечения язвенного колита[J J]. Углеводные полимеры, 2020, 230: 115613.

[24] MOINE L, CANALI M M, PORPORATTO C, et al. Reviewing biological activity of chitosan in the mucosa: Focus on intestinal im⁃ munity[J].   Международный журнал биологических макромолекул, 2021, 189: 324⁃334.

[25] LEE J, KIM M H, KIM H. Anti⁃oxidant and anti⁃inflammatory ef⁃ fects of astaxanthin on gastrointestinal diseases [J].  Международный журнал молекулярных наук, 2022, 23(24): 15471.

[26] TAO Y, ZHAO X, LIU X P, et al. Пероральная доставка покрытой хитозаном наноэмульсии PLGA с артезунатом облегчает язвенный колит у мышей[J].  Colloids and Surfaces B, Biointerfaces, 2022, 219: 112824.

[27] NA Y R, STAKENBORG M, SEOK S H, et al. Macrophages in in⁃ testinal inflammation and resolution: a potential therapeutic target in IBD[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2019, 16: 531⁃543.

[28] KOHANDEL Z, FARKHONDEH T, ASCHNER M, et al. Anti ⁃ in ⁃ flammatory action of astaxanthin and its use in the treatment of vari ⁃ ous diseases [J]. Биомедицина и фармакотерапия, 2022, 145: 112179.

[29] DEMIRCI ⁃ ÇEKIÇ S, ÖZKAN G, AVAN A N, et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defence [J]. Journal of Pharmaceuti⁃ cal and Biomedical Analysis, 2022, 209: 114477.