Исследование влияния астаксантина на структурную стабильность липосомальных фосфолипидных мембран

 Докозагексаеновая кислота (ДГК) - это незаменимая для развития мозга полиненасыщенная жирная кислота n-3, которая может способствовать развитию нервной системы и зрения[1], улучшать нарушения липидного обмена[2], а также предотвращать и облегчать нейродегенеративные заболевания[3]. 

Однако, поскольку организм не может синтезировать ДГК для удовлетворения собственных пищевых потребностей, ДГК должна поступать с пищей. По сравнению с ДГК типа этилового эфира и триацилглицерина, которые обычно встречаются в коммерческих продуктах, ДГК типа фосфолипида является идеальной формой добавки ДГК, поскольку она способствует обогащению ДГК в мозге[4-5] . Обогащенный ДГК фосфатидилхолин (ДГК-ПХ) является одним из основных классов фосфолипидов ДГК и широко распространен в морских организмах. Благодаря гидрофильной головной группе и гидрофобному хвосту жирной кислоты, DHA-PC способен самособираться в липосомы в водной среде, что может быть использовано для переноса активных веществ. Однако липосомы с ДГК-ПК подвержены перекисному окислению липидов из-за присутствия полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к дестабилизации структуры фосфолипидной мембраны липосом и образованию вредных оксигенированных продуктов, таких как альдегиды и эпоксидные группы[6] . H amadou et al[7] инкапсулировали антиоксидант β-каротин в морские фосфолипидные липосомы и обнаружили, что β-каротин может ингибировать реакцию перекисного окисления липидов, причем степень ингибирования достигает около 40%. Таким образом, добавление антиоксидантов является эффективным способом повышения структурной стабильности липидных мембран. Однако не сообщалось, что распределение и расположение антиоксидантов в липидных бислоях влияет на структуру и функции липосом.

 

Астаксантин - полярный каротиноид, обладающий в 10- и 20 раз большей антиоксидантной активностью, чем β-каротин и ликопин соответственно.8 Пан и др.[9] обнаружили, что астаксантин, содержащийся в липосомах лецитина соевых бобов, подавляет перекисное окисление липидов на 70%. Кроме того, Макналти и др[10] исследовали влияние различных молекулярных структур каротиноидов на стабильность фосфолипидных мембран, богатых полиненасыщенными жирными кислотами, и показали, что β-каротиноиды без терминальных гидроксильных групп, загруженные в липидные бислои, нарушают упорядоченность липидных бислоев, тогда как астаксантин сохраняет структурный порядок мембран. Расстояние между полярными концами с обеих сторон молекулярной основы астаксантина составляет 30 Å[11], что аналогично толщине липидного бислоя (25-32 Å)[12], что позволяет астаксантину быть прикрепленным к обеим сторонам фосфолипидной мембраны через полярные терминальные петли с обеих сторон структуры через липидный бислой[10, 13]. Такое двустороннее прикрепление к липидному бислою отличается от одностороннего прикрепления холестерина к липидному бислою[14], и его регулирующее влияние на структуру фосфолипидных мембран требует углубленного изучения.

 

ДГК-ПК - уникальный компонент морских фосфолипидов, и липидный бислой, образующийся в результате самосборки его молекул, необходимо нагружать стабилизаторами для повышения стабильности липосомной структуры. В данном исследовании астаксантин использовался в качестве мембранного стабилизатора для ДГК-ПК липосом, и ДГК-ПК липосомы, нагруженные астаксантином (Astaxanthin-embedded DHA-PC lipo- some , DPC-AST), были приготовлены методом введения этанола. Соотношение состава полиненасыщенных жирных кислот в DHA-PC сначала анализировали методом газовой хроматографии, а затем определяли микроструктурные характеристики и физико-химические свойства липосом, такие как размер частиц, коэффициент полидисперсности, дзета-потенциал и скорость инкапсуляции. Влияние астаксантина на механические свойства фосфолипидных мембран и способность к перекисному окислению липидов далее анализировали методами флуоресцентного зонда и реактива тиобарбитуровой кислоты, соответственно. Влияние астаксантина на механические свойства и устойчивость фосфолипидных мембран к перекисному окислению липидов было проанализировано с помощью методов флуоресцентного зонда и реактива тиобарбитуровой кислоты.

 

1 Материалы и методы

1 . 1 МАТЕРИАЛЫ

DHA-PC (чистота >80%) была очищена из яиц кальмара (Stheno-teuthis oualaniensis)[5]; астаксантин (чистота 95%) был приобретен у Shanghai Aradin Biochemical Technology Company Limited; трихлоруксусная кислота и 2-тиобарбитуровая кислота были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Company Limited; аммонийная соль 8-анилино-1-нафталинсульфоната, 1,6-дифенил-1,3,5,-гексатриен были приобретены у Shanghai Yuanye Biotechnology Company Limited. Ltd.; аммониевая соль 8-анилино-1-нафталинсульфокислоты, 1,6-дифенил-1,3,5,-гексатриен были приобретены у Shanghai Yuanye Biotechnology Co.

 

1 . 2 Инструменты

Газовый хроматограф: модель 78020, Agilent Technology Co., Ltd; термомешалка: модель DF-101S, Shanghai Qiangqiang Instrument & Equipment Co., Ltd; роторный испаритель: модель RE-2000A, Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory; UV-Vis спектрофотометр: модель UV-2355, Shanghai Unico Instrument Co. Nano ZS90, Malvern Instruments, Великобритания; ВЭЖХ: Модель 1260, Agilent Technologies Ltd, США; Прибор для многократного рассеяния света: LAB, Formulaction, Франция; Многофункциональный прибор для маркировки ферментов: Spark 10 M, TECAN, Швейцария; Флуоресцентный спектрофотометр: Модель F-460, Hitachi, Япония; UV-Vis спектрофотометр: Модель UV-2355, Unocal Instruments Ltd, Шанхай, Китай; Флуоресцентный спектрофотометр: Модель F-460, Hitachi, Япония. Спектрофотометр флуоресценции: модель F-4000, Hitachi, Япония.

 

1 . 3 Метод испытания

1 . 3 . 1 Газохроматографический анализ жирнокислотного состава DHA-PC Эталон Чжан

Газохроматографический анализ (ГХ) ДГК-ПК проводили по методу Sam et al[15] . Качественный анализ образцов проводили путем сравнения времен удерживания стандарта и образцов смеси метиловых эфиров. Условия ГХ-анализа были следующими: колонка представляла собой кварцевую капиллярную колонку Sup elco-wax (30 м×0,25 мм, 0,25 мкм); процедура нагревания колонки составляла 170 ℃ (0 мин) → 5 ℃/мин → 2 40 ℃ (222 мин), с равновесным временем 1 мин; температура порта впрыска составляла 260 ℃, а температура детектора 260 ℃; объем впрыска составлял 2 мкл; скорость потока составляла 200∶1; скорость потока водорода составляла 20∶1; образец анализировали методом ГХ-ГСА-ПХ. Объем инжекции составлял 2 мкл; коэффициент разделения составлял 2,0∶1; скорость потока водорода составляла 30 мл/мин, скорость потока воздуха составляла 40 0 мл/мин, а газом-носителем был высокочистый азот.

 

1 . 3 . 2 Приготовление и оптимизация DHA-PC с добавлением астаксантина

 

1 . 3 . 2 . 1 Приготовление ДПК-АСТ

Были приготовлены липосомы[16] . Согласно рецепту, брали 1 мл-5 мл этанольного раствора астаксантина и перемешивали при встряхивании, затем смешанный раствор вводили в водную фазу и перемешивали при постоянной температуре 37 ℃ в течение 40 мин, после чего этанол удаляли роторным выпариванием. Конечная концентрация DHA-PC в системе составляла 0,25 мг/мл.

 

1 . 3 . 2 . 2 Влияние объемного соотношения воды и этанола на размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) ДПК-АСТ           

Массовое соотношение DHA-PC и астаксантина составляло 1:0,10, а объемные соотношения водной и этанольной фаз - 2:1, 3:1, 4:1 и 5:1 для приготовления DPC-AST, соответственно. Размер частиц и PDI липосом определяли методом лазерного динамического рассеяния света (ЛДРС).

 

1 . 3 . 2 . 3 Влияние массового соотношения и времени инкубации на агрегационное поведение астаксантина

Объемное соотношение воды и этанола было зафиксировано на уровне 2∶1, а массовые соотношения DHA-PC и астаксантина составляли 1∶0,0,0 2, 1∶0,0,0 5 и 1∶0,1 0, соответственно. Этанольные растворы DHA-PC и астаксантина равномерно вводили в водную фазу после перемешивания, перемешивали при постоянной температуре 37 ℃ в течение 60 минут и снимали УФ-Vis спектры поглощения в диапазоне 3 500~7 000 нм в разные моменты времени инкубации.

1 . 3 . 2 . 4 Влияние соотношения масс на микроструктуру ДПК-АСТ       

DPC-AST готовили, фиксируя объемное соотношение воды и этанола 2:1 и качественные соотношения DHA-PC и астаксантина 1:0.02, 1:0.05 и 1:0.10, соответственно. Размер частиц, PDI и дзета-потенциал липосом определяли методом лазерного динамического рассеяния света.

1 . 3 . 3 Определение содержания астаксантина методом ВЭЖХ        

 

Содержание астаксантина в липосомах определяли по методу ссылки [17]. Нагрузку определяли как отношение количества астаксантина в липосоме к общему количеству каждого вещества в липосоме через отношение общего ввода астаксантина к стандартизованному третиноину. Условия ВЭЖХ были следующими: детектор - DAD-детектор; хроматографическая колонка - YMC Carotenoid C30 (4,6 мм×250 мм, 5 мкм); подвижные фазы - метанол и метил-трет-бутиловый эфир; скорость потока - 1 мл/мин; длина волны обнаружения - 478 нм; температура колонки - 30 ℃; объем впрыска - 30 мкл.

 

1 . 3 . 4 Оценка структурной стабильности липосом методом мультиплексного рассеяния света         

Структурная стабильность липосом определялась путем внесения 10 мл приготовленной суспензии липосом в специальный флакон MLS. Параметры были установлены на сканирование каждые 5 мин в течение 4 часов.

 

1 . 3 . 5 Определение текучести фосфолипидной пленки методом флуоресцентной полярографии       

Текучесть липосомных мембран определяли с помощью флуоресцентного зонда DPH[18] . Суспензию липосом смешивали с 500 мкл тетрагидрофуранового раствора DPH (0,086 ммоль/л) и инкубировали при 37 ℃ в течение 1 ч. Поляризация флуоресценции DPH-зонда измерялась с помощью многофункционального ферментного маркера. Длина волны возбуждения составляла 360 нм, а длина волны эмиссии - 430 нм.

 

1 . 3 . 6 Антилипидная перекисная способность астаксантина с помощью анализа на тиобарбитуровую кислоту       

Раствор трихлоруксусной кислоты-тиобарбитуровой кислоты-соляной кислоты (TBA-TCA-HCl) был приготовлен по методу Хуанга и др[19] . Нагруженные астаксантином и пустые липосомы инкубировали в водяной бане при 25 ℃ с открытой крышкой в течение 24 ч. В течение этого периода пробы отбирали каждые 4 ч. Добавляли 5 мл раствора TBA-TCA-HCl и липосомы охлаждали в ледяной бане после 30 мин в кипящей водяной бане. Интенсивность флуоресценции TBARS определяли методом флуоресцентной спектрофотометрии по методу He et al[20], при этом параметры флуоресцентной спектрофотометрии были установлены следующим образом: длина волны возбуждения 515 нм, длина волны эмиссии 553 нм, напряжение возбуждения 600 В, ширина щели 10 нм. Скорость изменения TBARS рассчитывали как отношение прироста интенсивности флуоресценции TBARS в момент времени t по отношению к образцу 0 ч к образцу 0 ч.

 

1 . 4 Обработка и анализ данных

В каждой группе было проведено по три параллельных эксперимента, данные анализировались статистически (ANOVA) с помощью программного обеспечения SPSS (IBM SPSS statistics 25) и считались значимыми при P < 0,0 5. Графики были построены с помощью программы Origin 2009.

 

2 Результаты и анализ

2 . 1 Жирнокислотный состав ДГК-ПК

Побочные продукты морских животных богаты фосфолипидами, а яйца кальмаров содержат 74,4 г фосфолипидов на 100 г общих липидов[21], что делает их хорошим источником морских фосфолипидов. Жирнокислотный состав ДГК-ПК, выделенного из яиц кальмара, представлен в таблице 1. В ДГК-ПК было обнаружено 17 жирных кислот, из которых три наиболее распространенные жирные кислоты - пальмитиновая (C1 6:0), ДГК (C2 2:6) и ЭПК (C2 0:5) - составили 2,9,54%, 2,6,50% и 1,3,59% соответственно, тогда как в широко распространенном коммерческом фосфатидилхолине (ФФХ) из яичного желтка ДГК составляла только 2,4%, 2,4,5% и 1,3,5%. Процентное содержание ДГК в широко продаваемом фосфатидилхолине из яичного желтка составляло всего 0,37 %[22] . Кроме того, Чэн Синьвэй проанализировал жирнокислотный состав яиц дорады и обнаружил, что содержание жирных кислот ДГК и ЭПК составляет 41,90 %, что не сильно отличается от содержания ДГК и ЭПК в ДГК-ПХ (40,09 %). Фосфолипиды, полученные из малоценных побочных продуктов переработки морских животных, богаты полиненасыщенными жирными кислотами, такими как ДГК и ЭПК, а морские фосфолипиды являются отличным сырьем для производства натуральных фосфолипидных липосом.

 

2 . 2 Приготовление и оптимизация липосом DHA-PC, нагруженных астаксантином (DPC-AST)

2 . 2 . 2 . 1 Влияние соотношения воды и этанола v/v на размер частиц и PDI DPC-AST       

Как и другие фосфолипиды, ДГК-ПК может самособираться в воде, образуя липосомы. В настоящем исследовании липосомы были приготовлены путем введения этанола, а этанол был выбран в качестве приемлемого растворителя для введения in vivo при низких концентрациях. Массовое соотношение DHA-PC и астаксантина было фиксированным и составляло 1:0,10, а объемное соотношение воды и этанола регулировалось для изучения влияния различных объемных соотношений воды и этанола на средний размер частиц и индекс полидисперсности DPC-AST, и результаты представлены в таблице 2. При объемном соотношении воды и этанола 2∶1 средний размер частиц DPC-AST составил (386 ± 8) нм, а PDI - 0,29 ± 0,04. Результаты представлены в таблице 2. При увеличении объема водной фазы средний размер частиц DPC-AST увеличивался с 364 нм до 716 нм, а значения PDI были значительно выше 0,3. Значения PDI DPC-AST и DPC-AST в водной фазе были значительно выше 0,3. PDI отражает распределение частиц в системе, и PDI менее 0,3 означает, что частицы липосом сконцентрированы и равномерно диспергированы[19] . Таким образом, DPC-AST был наиболее стабилен, когда объемное соотношение воды и этанола составляло 2:1. Sogali et al[24] обнаружили, что объемное соотношение воды и этанола оказывает значительное влияние на размер частиц и значение PDI липосом, а оптимальный размер частиц липосом находится в диапазоне 254-361 нм, а PDI - в диапазоне 0,35-0,43 при объемном соотношении растворителей 2,5:1. Таким образом, при приготовлении липосом методом введения этанола объемное соотношение воды и этанола является важным фактором, влияющим на распределение частиц по размерам липосом.

 

2 . 2 . 2 Влияние массового соотношения и времени инкубации на агрегационное поведение астаксантина

Хорошо известно, что массовое соотношение является ключевым параметром при приготовлении липосом, который влияет на размер частиц и скорость инкапсуляции липосом. Влияние массового соотношения DHA-PC и астаксантина на самосборку DPC-AST было дополнительно исследовано путем контроля соотношения воды и этанола в 2:1. Следует отметить, что Динг Лицзюнь[25] обнаружил, что после введения астаксантина и насыщенных фосфолипидов DPPC в водную фазу, агрегация астаксантина может быть вызвана путем инкубации астаксантина с водным раствором этанола в течение различных периодов времени. Поэтому в данном исследовании массовое соотношение и время инкубации анализировались вместе, и влияние времени инкубации на агрегационное поведение астаксантина при различных массовых соотношениях DHA-PC и астаксантина было исследовано методом сканирующей ультрафиолетовой абсорбционной спектроскопии (UV-AS), результаты которой представлены на рис. 1. При массовом соотношении DHA-PC и астаксантина 1:0,02 максимальная длина волны поглощения раствора находилась вблизи 480 нм через 2,5 мин инкубации (см. рис. 1(A)), что указывает на то, что астаксантин в это время существовал в основном в виде свободных мономеров. При увеличении времени инкубации до 40 мин максимальная длина волны поглощения сместилась к 490 нм, что указывает на то, что молекулы астаксантина начали подвергаться молекулярной агрегации. Однако основной формой астаксантина по-прежнему остаются свободные одиночные молекулы.

 

На рисунках 1(B) и 1(C) показано временное изменение поведения агрегации астаксантина при массовых соотношениях DHA-PC и астаксантина 1:0,05 и 1:0,10, соответственно. При этих двух массовых соотношениях максимальный пик поглощения астаксантина смещался в окрестности 5 20 нм с увеличением времени инкубации, сопровождаясь боковым пиком при 5 67 нм, что указывает на то, что астаксантин полностью сформировал J-агрегаты. Разница заключается в том, что при массовом соотношении 1:0,05 время образования J-агрегатов астаксантином составляло 30 мин, а при массовом соотношении 1:0,10 - 20 мин, что указывает на то, что чем выше концентрация астаксантина, тем легче молекулам агломерировать в растворителе для гидратации. Приведенные выше результаты показывают, что массовое соотношение DHA-PC и астаксантина и время инкубации могут оказывать важное влияние на распределение молекул астаксантина, загруженных в липидный бислой. При времени перемешивания более 40 мин загрузка астаксантина имела тенденцию к стабилизации, при которой астаксантин загружался в липидный бислой в виде одной молекулы при массовом соотношении DHA-PC и астаксантина 1∶0,02 и в основном в виде J-агрегатов при массовом соотношении 1∶0,05 и 1∶0,10, соответственно. При массовом соотношении 0,10 астаксантин загружался в липидный бислой преимущественно в виде J-агрегатов.

 

Серия липосом, несущих астаксантин, была получена путем вихревого перемешивания водно-этанольных растворов ДГК-ПК с астаксантином в соотношениях 1:0,02, 1:0,05 и 1:0,10 для удаления этанола. Липосомы были названы DPC-AST 2%, DPC-AST 4,8% и DPC-AST 9% в соответствии с соотношением массы астаксантина к общей массе астаксантина и DHA-PC, а также были приготовлены липосомы DHA-PC с пустым носителем (DPCs), и суспензии вышеуказанных липосом имели различные цвета из-за различий в форме загруженной формы астаксантина и содержания астаксантина (см. Рисунок 1(D)). 2% DPC-AST, загруженные в виде одной молекулы астаксантина, имели светло-оранжевый цвет, в то время как 4,8% и 9% DPC-AST, загруженные в виде J-полимера астаксантина, имели светло-розовый и темно-розовый цвета, соответственно.

 

2 . 2 . 3 Влияние массового соотношения на микроструктуру, скорость инкапсуляции и загрузку липосом      

Липосомы, нагруженные различными формами и дозировками астаксантина, были получены в соответствии с оптимизированными условиями приготовления, и влияние соотношения ДГК-ПК и астаксантина на микроструктуру и скорость инкапсуляции липосом сравнивали с ДГК-ПК, результаты представлены в таблице 3. По сравнению с пустым ДПК (57,4 нм), размер частиц ДПК-АСТ значительно увеличился (P < 0,05) до 200-40 нм после загрузки астаксантина и показал зависимость от нагрузки. Это объясняется двумя причинами: во-первых, по мере увеличения процентного содержания астаксантина в системе ДГК-ПК и астаксантина с 2% до 9% нагрузка астаксантина увеличивалась соответственно, что приводило к увеличению толщины липидного бислоя и увеличению размера частиц. Jing YK et al[26] также обнаружили, что размер частиц липосом увеличивается с увеличением количества астаксантина. Во-вторых, различия в размере частиц обусловлены загрузкой астаксантина в липосомы.

 

Как упоминалось выше, при массовом соотношении DHA-PC и астаксантина 1:0,02 астаксантин, загруженный в липидный бислой, был в основном в виде одной молекулы, тогда как при массовых соотношениях 1:0,05 и 1:0,10 астаксантин, содержащийся в липидном бислое, был в основном в виде J-агрегатов. Лу и др.[27] провели анализ с помощью моделирования абсорбционной спектроскопии и обнаружили, что расчетные расстояния между молекулами в J-агрегатах астаксантина составляли 0,668 нм. 8 нм. Таким образом, пространственная занятость уложенных J-агрегатов астаксантина значительно превышает длину их отдельных молекул (30 Å), что приводит к значительному увеличению размера липосомных частиц. Результаты PDI показали, что значение PDI для DPC составило 0,62, что указывает на то, что липосомные частицы, сформированные только DHA-PC, не были равномерно распределены. Однако добавление астаксантина позволило снизить значение PDI липосом примерно до 0,3, что говорит о том, что добавление астаксантина может сузить распределение частиц по размерам липосом без помощи ультразвука и гомогенизации под высоким давлением, а также в определенной степени улучшить стабильность и однородность дисперсии липосом. Кроме того, потенциалы DPC и DPC-AST находились в диапазоне -27~-33 мВ, что указывает на отсутствие значительного влияния загрузки астаксантина на распределение зарядовых групп на поверхности липосомных частиц.

 

Скорость инкапсуляции и несущая способность являются показателями способности структуры носителя инкапсулировать загруженные молекулы. Сравнивая скорости инкапсуляции липидов с различными массовыми соотношениями, можно заметить, что эффективность инкапсуляции астаксантина в фосфолипидную мембранную структуру была выше 80%, что указывает на то, что DHA-PC может эффективно инкапсулировать астаксантин. При увеличении процентного содержания астаксантина с 2 до 9 % скорость инкапсуляции увеличивалась, а затем уменьшалась. DPC-AST 4,8 % имеет самую высокую степень инкапсуляции 93,5 %, а DPC-AST 9 % имеет самую низкую степень инкапсуляции 84,6 %. Это объясняется тем, что при содержании астаксантина 9 % плотность распределения астаксантина в липидном бислое была насыщена и не могла вместить большее количество астаксантина. Кроме того, загрузочная способность липосом увеличивалась с ростом процентного содержания астаксантина, что говорит о том, что астаксантин может быть эффективно загружен в липидный бислой в диапазоне от 2 до 9 %.

 

2 . 3 Астаксантин стабилизирует структуру липосомной мембраны

Липосомы - термодинамически нестабильные системы, и структура мембраны обычно дестабилизируется из-за флокуляции и миграции частиц, поэтому важно исследовать изменения частиц липосом для изучения их стабильности. В отличие от общих исследований стабильности, многократное рассеяние света (MLS) может быть использовано для мониторинга изменений размера и положения частиц вследствие флокуляции и агломерации в режиме реального времени без разбавления образца. Изменение скорости передачи (RT) от дна раствора к верхней части поверхности жидкости за время измерения может отражать изменения стабильности коллоидных частиц, такие как седиментация, подъем или флокуляция [28-29]. Поэтому в настоящем исследовании мы использовали прибор многократного светорассеяния для полной характеристики всех эффектов физической нестабильности при загрузке астаксантина на структуру липосомной мембраны путем определения значений RT для различных высот суспензий липосом в течение 4 ч в отсутствие внешних раздражителей, т.е. суспензии липосом находились в невозмущенном и бесконтактном состоянии. Как показано на рис. 2, горизонтальные координаты сканов представляют собой высоту образцов, а нижняя, средняя и верхняя части образцов представлены слева направо. Вертикальные координаты представляют RT, а различные цветные кривые - изменения RT в разные моменты времени. Сдвиги вверх и вниз левой и правой кривых связаны с опусканием и всплытием липосом, а плоский сдвиг средней кривой связан с изменением размера частиц.

 

Кривые RT в нижней и средней частях образцов DPC и DPC-AST не претерпели значительных изменений со временем, что указывает на отсутствие значительного осаждения или агрегации липидов в нижней и средней частях образцов. В верхней части образцов кривые RT со временем смещались вверх (см. стрелки на рис. 2), что говорит о возможном осветлении верхнего слоя образцов в результате осаждения частиц, приводящем к увеличению RT. По сравнению с ДПК и ДПК-АСТ 2 %, верхние кривые RT ДПК-АСТ 4,8 % и ДПК-АСТ 9 % меньше изменялись со временем, что говорит о меньшем осветлении верхнего слоя образцов и лучшей структурной стабильности астаксантинсодержащих липосом.

 

Стабильность липосом далее оценивали количественно с помощью программного обеспечения для анализа многократного светорассеяния, выражая суммарное значение каждого изменения RT при 25 ℃ в течение 4 ч как индекс нестабильности Турбиса (TSI). Чем больше TSI, тем более нестабильным является образец[29] . На рисунке 3 показано, что TSI ДПК быстро увеличился до 0,91 в первые 300 с, а к концу испытания TSI ДПК составил 1,20. TSI ДПК-АСТ увеличивался быстрее, чем TSI ДПК-АСТ. Скорость увеличения ДПК-АСТ была медленнее, чем ДПК, и значения TSI ДПК-АСТ 2%, ДПК-АСТ 4,8% и ДПК-АСТ 9% в конце испытания составили 1,15, 0,58 и 0,55, соответственно, что было меньше, чем у ДПК, что говорит о том, что включение астаксантина может улучшить структурную стабильность ДПК. Дальнейшее сравнение значений TSI ДПК-АСТ в то же время показало, что значения TSI липосом были наименьшими, когда астаксантин составлял 4,8% и 9%, т.е. астаксантин был встроен в липидный бислой в виде J-агрегатов, что указывает на то, что загрузка J-агрегатов астаксантина была наиболее выгодной для стабилизации структуры липидного бислоя.

 

2 . 4 Регулирование текучести липосомной мембраны астаксантином

Подвижность - важное свойство фосфолипидных бислоев, которое может влиять на проницаемость большинства веществ и, следовательно, на структурную стабильность липидов[30] . Наличие ненасыщенных связей в фосфолипидной основе снижает упорядоченность межмолекулярного расположения мембранных липидов, тем самым увеличивая текучесть мембраны. 1,6-Дифенил-1,3,5,-гексатриен (DPH) - липофильный флуоресцентный зонд, который может быть введен в центральную гидрофобную область, образованную расположением цепей жирных кислот в хвосте фосфолипидов, и изменение поляризации его флуоресценции может отражать подвижность липидных цепей[31] . На рисунке 4 показано влияние астаксантина в DHA-PC и астаксантина на поляризацию флуоресценции DPH в липидном бислое липосом. По сравнению с поляризацией флуоресценции, измеренной в ненагруженном DPC (0,11), DPC-AST, нагруженный астаксантином, показал более высокую поляризацию флуоресценции (P < 0,05), что указывает на то, что астаксантин, загруженный в DPC-AST, ограничивал движение DPH и в определенной степени уменьшал гидрофобную область центральной липофобной области липосом. Это указывает на то, что загрузка астаксантина ограничивала движение DPH и в некоторой степени снижала подвижность цепей жирных кислот в центральной гидрофобной области липосом.

 

Удивительно, но при увеличении процентного содержания астаксантина с 2% до 9% поляризация флуоресценции не увеличивалась, а уменьшалась с 0,2 до примерно 0,1, что указывает на то, что астаксантин, загруженный в липидный бислой, может регулировать подвижность центральной гидрофобной области фосфолипидной мембраны, что предположительно связано с формой астаксантина, загруженного в липидный бислой. В DPC-AST 2% астаксантин в основном встраивался в липидный бислой в виде одной молекулы с молекулярной длиной около 30 Å. Взаимодействие между α-гидроксикетонами с обеих сторон основы астаксантина и гидроксильными группами соседних молекул фосфолипидов усиливалось, а сопряженная полиенильная цепь основы астаксантина ограничивала движение гибких цепей полиненасыщенных жирных кислот в гидрофобной области, что приводило к уменьшению текучести липидной мембраны. Другие исследования показали, что закрепление астаксантина на границе раздела липид-вода с обеих сторон мембраны способствует возникновению ван-дер-ваальсовых сил между сопряженными с астаксантином полиеновыми цепями и ацильными цепями липидов во внутренней гидрофобной области[32], что приводит к повышению жесткости липосомных мембран после загрузки астаксантина[13]. Однако при увеличении процентного содержания астаксантина до 4,8 % и 9 %, астаксантин, загруженный в липосому, в основном представляет собой J-агрегат, т.е. молекулы астаксантина свободно уложены в виде "лестницы" голова к хвосту, и только одна сторона агломерированной основы астаксантина, α-гидроксикетон, участвует в нековалентных взаимодействиях с гидроксильными группами соседних молекул фосфолипида, поэтому увеличивается движение молекулярных цепей фосфолипида и повышается текучесть мембраны. Таким образом, движение молекулярных цепей фосфолипидов увеличивалось, а текучесть мембраны повышалась. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что способ распределения астаксантина в липидных бислоях, т.е. мономерное или агрегатное распределение, может регулировать текучесть мембран липосом.

 

2 . 5 Способность к перекисному окислению антилипидов

Наличие цепочек полиненасыщенных жирных кислот в молекулярном скелете фосфолипидов может легко привести к перекисному окислению липидов во время обработки или хранения, что приводит к дестабилизации структуры и утечке продуктов окисления или лекарств[3 3] . Для того чтобы оценить влияние загрузки астаксантина на окислительную стабильность липосом ДГК-ПК, увеличение TBARS в ДПК и ДПК-АСТ 9% определяли методом реактивов тиобарбитуровой кислоты (TBARS) в течение 24 ч при комнатной температуре. На рисунке 5 показано, что TBARS в ДПК увеличился на 90,71% за 24 ч, что указывает на способность липосом к спонтанному окислению при воздействии атмосферных условий. Для сравнения, DPC-AST 9% увеличился только на 35,86% в тех же условиях, что указывает на то, что загрузка астаксантина в липосомы значительно уменьшила производство TBARS. Tan et al.[34] сообщили, что загрузка липосом каротиноидами, такими как лютеин, ингибировала производство TBARS в спонтанном окислении липосом в течение 2 ч при комнатной температуре, и отрицательное увеличение TBARS в загруженных липосомах по сравнению с пустыми липосомами (37%). По сравнению с увеличением TBARS в пустых липосомах (37%), увеличение TBARS в липосомах, нагруженных 2% лютеина, составило всего около 10%.

 

3 Заключение

В данной работе липосомы DHA-PC, нагруженные астаксантином, были приготовлены методом введения этанола, и были определены ключевые параметры приготовления, такие как соотношение растворителей и время смешивания растворителей. Сравнивая влияние различных процентных долей астаксантина на скорость инкапсуляции, самоагрегацию и текучесть липосом, было установлено, что образование агрегатов астаксантина является эффективным способом увеличения загрузки астаксантина в липосомы, а агрегатное состояние встроенного астаксантина в бислой может регулировать текучесть липидных мембран, что может улучшить структурную стабильность липидных мембран с точки зрения механических характеристик мембраны и антиоксидантных свойств. Конечно, стабильность липосом, нагруженных астаксантином, в процессе хранения и транспортировки in vivo нуждается в дальнейшем изучении. Результаты данного исследования могут служить теоретическим обоснованием применения природных фосфолипидов, особенно морских фосфолипидов, богатых полиненасыщенными жирными кислотами, в продуктах питания и лекарственных препаратах.

 

Ссылки.

[1] Sugasini D , Yalagala P C R , Subbaiah P V. Эффективное обогащение ретинальной ДГК с помощью диетического лизофосфатидилхолин-ДГК: потенциальное применение для лечения retinopathies[J] .  Nutrients, 2020, 1 2(1 0) : 3 1 1 4 .

[2] Ding L, Zhang T T, Che H X, et al. DHA-enriched phos phatidyl-

Холин и фосфатидилсерин, обогащенные ДГК, улучшают возрастные нарушения липидного обмена за счет различных видов метаболизма у сенильных мышей. ускоренной мыши[J] .  European Journal of Lipid Science and Technology , 2 0 1 8 , 1 2 0(6) : 1 7 0 0 4 9 0 .

[3] Xiao M, Xiang W, Chen Y S, et al. DHA улучшает когнитивные способности.

улучшает состояние здоровья, уменьшает отложение амилоида и производство нервных волокон при болезни Альцгеймера[J] .  Frontiers in Nutrition, 2 0 2 2 , 9 : 8 5 2 4 3 3 .

[4] Chouinard W R , Lacombe R J S , Metherel A H , et al. DHA, этерифицированная фосфатидилсерином или фосфатидилхолином, более эффективна для воздействия на мозг мозга, чем ДГК, этерифицированная в триацилглицерин [J] .  Molecular Nutrition & Food Research , 20 1 9 , 6 3(9) : 1 80 1 2 24.

[5] Wu F, Wang D D, Wen M, et al. Сравнительный анализ ДГК-фосфатидилхолина и рекомбинации ДГК-триглицерида с яичным фосфатидилхолином или глицерилфосфорилхолином на восстановление ДГК у мышей с дефицитом n-3 [J] . или глицерилфосфорным илхолином на реплетирование ДГК у мышей с дефицитом n-3[J] .   Lipids in Health and Disease , 2 0 1 7 , 1 6(1) : 2 3 4 .

[6] Cwiklik L , Jungwirth P. Массивное окисление фосфолипидных мем - бранов приводит к образованию пор и распаду бислоя[J] .  Chemi- cal Physics Letters , 2 0 1 0 , 4 8 6(4-6) : 9 9-1 0 3 .

[7] Hassane H A , Zhang J Y , Chen C , et al. Витамин C и β-каротин, загруженные в морские и яичные нанолипосомы[ J] .   Журнал пищевой инженерии, 2 0 2 3 , 3 40 : 1 1 1 3 1 5 .

[8] Zhao T , Yan X J , Sun L J , et al. Исследования прогресса в области экстракции, биологической активности и систем доставки натурального астаксантина[J] .  Trends in Food Science & Technology, 2 0 1 9 , 9 1 : 3 5 4-3 6 1 .

[9] Pan L , Zhang S W , Gu K R , et al. Preparation of astaxanthin- loaded lipo somes: Characterisation, storage stability and antioxi- dant activity [J] .  CyTA-Journal of Food, 2 0 1 8 , 1 6(1) : 6 0 7-6 1 8 .

[1 0] Mcnulty H P , Byun J , Lockwood S F , et al. Дифференциальное влияние каротиноидов на перекисное окисление липидов из-за мембранных взаимодействий: рентгеновский дифракционный анализ[J] .  Biochim Bio ph ys Acta, 2 0 0 7 , 1 7 6 8 (1) : 1 6 7-1 7 4 .

[1 1] Milon A , Wolff G , Ourisson G , et al. Organization ofcarotenoidphospholipid bilayer systems. incorporation of zeaxanthin , astax- anthin , and их C5 0 гомологов в димиристоилфосфатидил-холиновые везикулы[J] .   Helvetica Chimica Acta, 1 9 8 6 , 6 9 ( 1) : 1 2- 2 4 .

[1 2] Wisniewska A , Sub czynski W K. Effects of polar carotenoids on the shape of hydrophobic barrier of phospholipid bilayers [J] . Biochim Bio ph ys Acta, 1 9 9 8 , 1 3 6 8(2) : 2 3 5-2 4 6 .

[1 3] Ding L J , Yang J , Yin K R , et al. Пространственное расположение астаксантина в бислое значительно повлияло на структурную стабильность липосом DPPC[J] .  Colloids and Surfaces B Biointerfaces , 2 0 2 2 , 2 1 2 : 1 1 2 3 8 3 .

[1 4] Bui T T , Suga K , Umako shi H. Роль производных стерола в регулировании свойств фосфолипидных бислойных систем[J] .  Lang- muir , 2 0 1 6 , 3 2 (2 4) : 6 1 7 6-6 1 8 4 .

[1 5] Zhang C , Luan D L , Zhao Y C , et al. Быстрое определение до-козагексаеновой кислоты и астаксантина в яйцах на основе гиперспектральной визуализации [J] .  Journal of Food Safety & Quality, 2 0 2 0 , 1 1 ( 2 1) : 8 0 1 0-8 0 2 0 .

[Aj eeshkumar K K , Aneesh P A , Raju N , et al. Advancements in lipo some technology: Preparation techniques and applications in food, functional foods, and bioactive delivery : A review [ J] . и доставка биоактивных веществ: обзор [ J] .  Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 2 0 2 1 , 2 0(2) : 1 2 8 0-1 3 0 6 .

[1 7] Dai M Q , Li C J , Yang Z , et al. Модель агрегации астаксантина сильно влияет на его антиоксидантную активность: сравнительное исследование в клетках Caco-2[J ] .  Антиоксиданты, 2 0 2 0 , 9(2) : 1 2 6 .

[1 8] Tai K D , Liu F G , He X Y , et al. Влияние стериновых производных на свойства липосом лецитина сои и яичного желтка: стабильность, структура и мембранные характеристики [J] .   Food Research International, 2 0 1 8 , 1 0 9 : 2 4-3 4 .

[ 1 9] Huang M G , Liang C P , Tan C , et al. Lipo some co-encapsulation as a strategy for delivery of curcumin and resveratrol[ J] . Food & Function, 2 0 1 9 , 1 0(1 0) : 6 44 7-6 4 5 8 .

[2 0] He K , Nukada H , Urakami T , et al. Антиоксидантные и про-оксидантные свойства пирроло-хинолин-хинона (PQQ): влияние на его функцию в биологических системах[J] .   Biochem Pharmacol, 2 0 0 3 , 6 5(1) : 6 7-7 4 .

[2 1] Wang Q , Xue C H , Xu J , et al. Определение фосфолипидов в яйцах/гонадах из нескольких водных продуктов с помощью ВЭЖХ-ELSD[ J] .  Аналитическое приборостроение, 2 0 1 2(5) : 1 8-2 2 .

[2 2] Zhu S. Экстракция и ферментативное преобразование фосфатидилхолина яичного желтка[D] .  Пекин: Пекинский университет химической технологии, 2 0 2 2 .

[2 3] Cheng X W. Выделение и характеристика фосфолипидов и оценка эффективности пролиферации клеток He pG2 с помощью фос phatidylcholine Derived from Large Yellow Croaker Roe [D] .  Фучжоу: Фуцзяньский университет сельского и лесного хозяйства, 2 0 1 7 .

[2 4] Sogali B S , Bhattacharyya S. Применение статистического дизайна для оценки критических параметров процесса метода введения этанола для приготовления липосомов[J] .  Dhaka University Journal of Pharmaceutical Sciences, 2 0 1 9 , 1 8(1) : 1 0 3-1 1 1 .

[2 5] Ding L J. Влияние пространственного расположения астаксантина на структурную стабильность липосом[D] .  Циндао: Океанский университет Китая, 2 0 2 2 .

[2 6] Jing Y K , Zhang W , Gao H , et al. Optimization of preparation of astaxanthin nanolipid carrier based on central composite method [J] .  China Oils and Fats , 2 0 2 4 , 4 9(1) : 7 1-7 8 .

[2 7] Lu L P , Hu T P , Xu Z G. Structural characterization of astaxanthin aggregates as revealed by analysis and simulation of optical spectra [J] .  Spectrochimica Acta Part A Molecular and Biomolec- ular Spectroscopy , 2 0 1 7 , 1 8 5 : 8 5-9 2 .

[ 2 8 ] Mengual O, Meunier G, Cayre I, et al. Turbiscan Ma 2 0 0 0: измерение многократного светорассеяния для анализа нестабильности концентрированных эмульсий и суспензий. анализ нестабильности концентрированных эмульсий и суспензий[J] .  Таланта, 1 9 9 9 , 5 0 ( 2) : 44 5 - 4 5 6 .

[2 9] Xia Z H. Исследование стабильности наносеребряных коллоидов[D] .   Тянь-цзинь: Тяньцзиньский университет, 2 0 1 4 .

[3 0] Lande M B , Donovan J M , Zeidel M L. The relationship between membrane fluidity and permeabilities to water , solutes , ammo- nia , and protons [J] .  Журнал общей физиологии, 1 9 9 5 , 1 0 6(1) : 6 7-8 4 .

[3 1] Wang R F , Peng J M , Shi X , et al. Изменение текучести мембраны, вызванное полифенолами, сильно зависит от положения и количества галлоильных групп[J] .  Biochim Bio ph ys Acta Biomembr , 2 0 2 2 , 1 8 6 4(1 1) : 1 8 40 1 5 .

[3 2] Liang J , Tian Y X , Yang F , et al. Антиоксидантный синергизм между каротиноидами в мембранах. астаксантин как радикальный транс-ферный мост [J] .  Пищевая химия, 2 0 0 9 , 1 1 5(4) : 1 4 3 7-1 44 2 .

[3 3] Asayama K , Aramaki Y , Yoshida T , et al. Permeabilitychanges by peroxidation of unsaturated lipo somes with ascorbic acid/Fe2+ [J] .  Journal of Lipo some Research, 2 0 0 8 , 2(2) : 2 7 5-2 8 7 .

[3 4] Tan C, Xue J, Abbas S, et al. Lipo some as adelivery system for carotenoids: Comparative antioxidant activity of carotenoids as measured by ferric Сравнительная антиоксидантная активность каротиноидов, измеренная по ферритной антиоксидантной силе, DPP H Assay и перекисному окислению липидов[J].  Journal of A