Как УФ-В влияет на рост и накопление астаксантина в Rhodococcus rainbowensis?

 Свет не только обеспечивает растения энергией для фотосинтеза, но и служит сигнальным фактором окружающей среды, регулирующим весь жизненный цикл растений - от прорастания семян до цветения и плодоношения. В последние годы разрушение озонового слоя привело к увеличению количества ультрафиолетового излучения, достигающего земли. Ультрафиолетовое излучение стало важным экологическим фактором, влияющим на рост и развитие растений [1].

 

Чтобы адаптироваться к динамично меняющейся световой среде, растения создали сложную систему фоторецепторов, которая воспринимает различные длины волн солнечного света через фоторецепторы и регулирует экспрессию соответствующих генов, модификацию и взаимодействие белков в растениях через сигнальную сеть, направляя таким образом реакции растений в области физиологии, биохимии, роста и развития. Например, коротковолновое, высокоинтенсивное и повреждающее УФ-В вызывает стрессовые реакции у растений, вызывая повреждение ДНК и образование реактивных видов кислорода, а также ускоряя старение или гибель растений[2]; низкоинтенсивное и неповреждающее УФ-В положительно регулирует различные процессы развития, такие как фотоморфогенез, укорачивание гипокотиля, расширение котиледона, накопление флавонолов и антоцианов[3-5] . -5].

 

Haematococcus pluvialis, пресноводная одноклеточная зеленая водоросль, является видом с самым высоким содержанием астаксантина, и большинство исследователей считают, что свет (интенсивность света, качество света и фотопериод) является важным фактором, влияющим на синтез астаксантина в Haematococcus pluvialis [6]. Ультрафиолетовое излучение также влияет на водные экосистемы, и было обнаружено, что умеренное количество ультрафиолетового излучения может способствовать накоплению астаксантина в Rhodococcus rainbowensis [9], но то, как клетки Rhodococcus rainbowensis воспринимают и передают свет, может быть основным фактором синтеза астаксантина [10]. Однако механизм того, как клетки Rhodococcus rainieri воспринимают и передают световые сигналы для регулирования накопления астаксантина, не ясен.

 

UVR8 (UV-Resistance locus 8) был впервые идентифицирован как УФ-В-специфический фоторецептор из Arabidopsis thaliana. Фотоактивация UVR8 зависит от поглощения УФ-В света остатками триптофана в определенных местах. В отсутствие УФ-В β-пропеллерный белок Heptahepta существует в форме гомодимера; когда присутствует УФ-В, он способствует диссоциации гомодимера, вызывая мономерность UVR8, который взаимодействует с доменом повторов WD40 белка COP1 и накапливается в ядре, вызывая фотоморфологические реакции и УФ-В акклиматизацию [10]. UVR8 контролирует экспрессию генов, связанных с биосинтезом УФ-В-поглощающих метаболитов, восстановлением ДНК и защитой от окислительного стресса[12] .

 

Помимо фоторецепторов, важную роль в световом ответе играют и многие другие компоненты, включая COP1 (Constitutively Photomorphogenic 1), SPA1 (suppressor of PHYA-105 1), HY5 (Elong- ated Hypocotyl 5), HYH (HY5- Homolog), RUP1/2 (Repressorof UV-B Photomorphogenesis 1/2) и PIFs (Phytochrome-interacting Factor 1) и др. Гомолог), RUP1/2 (Repressorof UV-B Photomorphogenesis 1/2) и PIFs (Phytochrome-interacting Factor 1) [13-15]. Полноразмерная последовательность кДНК гена UVR8 была клонирована из Rhodococcus pyrenoidus, и были проанализированы его физико-химические свойства и структура белка[16] . На основании предыдущих исследований в данной работе мы рассматриваем влияние УФ-В излучения на экспрессию гена UVR8 и ключевых генов синтеза астаксантина в Rhodococcus pyrenoidus, а также влияние УФ-В излучения на световые сигнальные пути. Мы сосредоточились на профилях экспрессии UVR8, COP1, SPA1, HYH и HY5, которые являются основными компонентами сигнального пути UV-B у высших растений [17-20], чтобы заложить основу для углубленного анализа транскрипционных и регуляторных механизмов светоиндуцированного синтеза астаксантина и сигнального механизма UV-B в зеленых водорослях.

 

1 Материалы и методы

1.1 Виды водорослей

Haematococcus pluvialis FACHB- 712 был приобретен в Банке видов пресноводных водорослей Института водной биологии Китайской академии наук и хранился в нашей лаборатории. Условия культивирования составляли 25 мкмоль/(м2 -с) (светодиодный белый свет), 25 ℃, цикл свет-темнота 12:12 (L:D), статическая инкубация и встряхивание руками 2-3 раза в день.

 

1.2 Система УФ-В излучения

Источником искусственного УФ-В света служила узкополосная УФ-В лампа Philips TL20W/01RS мощностью 15 Вт (311 нм), интенсивность которой регулировалась путем изменения расстояния между конической колбой и УФ-В лампой, интенсивность света измерялась с помощью люксметра TES 1332A, а перед испытанием система стабилизировалась 24 ч непрерывного облучения.

 

Клетки водорослей на поздней логарифмической стадии роста собирали центрифугированием и ресуспендировали в свежей среде MCM после 24 ч темновой обработки, а затем культивировали при интенсивности света 25 мкмоль/(м2 -с) (дополненной УФ-В излучением различной интенсивности). Нормальная группа (CK), 100 лк УФ-B излучения (U100), 200 лк УФ-B излучения (U200), 300 лк УФ-B излучения (U300), 400 лк УФ-B излучения (U400) и 500 лк УФ-B излучения (U500) были помечены как нормальная группа, температура инкубации была 25℃, встряхивание 2 раза в день, температура инкубации была 25℃. Температура инкубации составляла 25℃, образцы встряхивали 2-3 раза в день. Образцы для определения физиологических показателей брали регулярно каждые 24 часа.

 

1.3 Физиологические показатели

Кривую роста определяли, отбирая 1 мл каждой культуры и перенося ее микропипеткой в гематокритный планшет, где клетки подсчитывали под световым микроскопом, подключенным к компьютеру с программным обеспечением Optilab.

Фотосинтетическую активность измеряли с помощью импульсно-модулированного хлорофиллового флуорометра Mini-PAM-II/B (H. Walz. Effeltrich, Ger- many) для определения процесса вспышки флуоресценции хлорофилла при комнатной температуре. 3 мл сока водорослей было взято из каждой группы, и образцы были адаптированы к темноте в течение 10 мин перед измерением. Максимальная фотохимическая эффективность PSII (Fv/Fm) была рассчитана по формуле Fv/Fm = ( Fm Fo)/Fm, NPQ (Non-photochemical quenching parameter) - коэффициент нефотохимической вспышки, и rETR (Relative electron transport rate) - коэффициент нефотохимического тушения. Максимальную фотохимическую эффективность (Fv/Fm) PSII рассчитывали по формуле Fv/Fm=( Fm Fo)/Fm, NPQ (Non-photochemical quenching parameter) - коэффициент нефотохимического тушения, rETR (Relative electron transport rate) - относительная скорость переноса электронов.

 

Определение хлорофилла a и хлорофилла b Хлорофилл a и хлорофилл b экстрагировали 95% этанолом, центрифугировали и измеряли спектры поглощения супернатанта на УФ-спектрофотометре (Metash UV-6000PC) по формулам Хл. a (мг/л)=(12,7×A663-2,69×A645) Va/Vb, Хл. b (мг/л)=(22,9×A645-4,86×A663) Va/Vb, и Хл. Хл. a (мг/л)=(12,7×A663-2,69×A645) Va/ Vb, и Хл. b (мг/л)=(22,9×A645-4,86×A663) Va/ Vb были использованы для расчета хлорофилла a и хлорофилла b (Va и Vb представляют собой объем образцов 95% этанола и микроводорослей, соответственно).

 

Содержание астаксантина определяли модифицированным методом Буссибы [22], используя 5% KOH + 30% метанол для омыления хлорофилла, затем экстрагируя астаксантин диметилсульфоксидом, измеряя поглощение света при 490 нм и рассчитывая содержание астаксантина по формуле C(мг/л) = (4,5 × A490 × Va)/ Vb [23] (Va и Vb представляют собой объем диметилсульфоксида и образцов микроводорослей, соответственно). Va и Vb представляют собой объем диметилсульфоксида и образцов микроводорослей, соответственно).

 

1.4 Количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени

Влияние УФ-В излучения на уровень транскрипции гена UVR8, генов, связанных с синтезом астаксантина (IPI, BCH, PSY и BKT), и генов, связанных с путем трансдукции светового сигнала (COP1, SPA1, HYH и HY5) в Rhodococcus pyrenoidus, исследовали методом qRT-PCR. Суммарную РНК выделяли с помощью реактива Trizol в соответствии с инструкцией, концентрацию и чистоту определяли на спектрофотометре Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000. КДНК подвергали обратной транскрипции в кДНК в соответствии с процедурой из приобретенного набора (PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser) и проводили qRT-PCR для амплификации продукта размером 100-250 п.н. Используемые праймеры представлены в таблице 1, а система флуоресцентной количественной реакции в реальном времени основана на SYBR® Premix Ex Taq™ II (Taq). Taq™ II (TaKaRa), и каждый образец повторяли три раза.

 

1.5 Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с помощью программы SPSS 16.0, а построение графиков - с помощью программы Origin9 (OriginLab Corporation, США).

 

2 Результаты

2.1 Влияние УФ-B излучения на рост Rhodococcus rainbowensis

Как показано на рис. 1а, цвет водорослевого раствора Rhodococcus amazonensis значительно изменялся под действием УФ-В излучения. Цвет водорослевого раствора группы с высокой интенсивностью УФ-В излучения (U300 и U400) был красновато-коричневым по сравнению с группой CK, цвет водорослевого раствора становился темнее с увеличением времени воздействия света, но при увеличении интенсивности УФ-В излучения до 500 лк цвет водорослевого раствора становился светлее. Дальнейшее наблюдение за морфологией клеток водорослей показало, что в условиях УФ-В излучения клетки Rhodococcus amarus были в основном зелеными неподвижными клетками, которые постепенно превращались в споры красного цвета при увеличении времени инкубации. Как показано на рис. 1b, клетки водорослей были слегка красноватыми в течение 36 часов, площадь красноватых клеток постепенно увеличивалась с увеличением времени, и клетки водорослей группы U400 были полностью красными в течение 72 часов.

 

После УФ-В облучения рост клеток в группе высокой интенсивности показал тенденцию к увеличению, а затем уменьшению, как показано на рис. 1c, первые 24 ч УФ-В излучения способствовали росту водорослей, а затем с усилением УФ-В излучения рост водорослевых клеток был подавлен, и биомасса резко снизилась через 48 ч, а биомасса клеток в группе высокой интенсивности (U400 и U500) снизилась на 100-250 п.н. через 72 ч. Используемые праймеры приведены в таблице 1, количественная флуоресцентная реакция в реальном времени проводилась в соответствии с инструкциями SYBR® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa), каждый образец повторялся три раза.

 

2.2 Влияние УФ-B излучения на фотосинтез Rhodococcus rainbowensis

При УФ-В облучении Fv/Fm Rhodococcus rainbowensis снижался с увеличением продолжительности облучения, причем снижение было пропорционально интенсивности УФ-В (рис. 2а).

Таблица 1 Названия и последовательности праймеров, использованных в данном исследовании Таблица 1 Праймеры, использованные в данном исследовании

 

Последовательность праймеров (5′-3′) использование использование использование
UVR8-F	GCAGAGTATTCTTGGCCGTGTC qRT-PCR
UVR8-R	GGAGGAACTGGTCCGTGGTG qRT-PCR
BCH-F	ACTCTCCCCTCTTGGTGGT	qRT-PCR
BCH-R	GGCAGTCCATTGATGATTG	qRT-PCR
BKT-F	AGTGGCTGAGATGGAGTT	qRT-PCR
BKT-R	ctaagtgctggtgctgaa	qRT-PCR
PSY-F	cagacctgagcacatagc	qRT-PCR
PSY-R	CCATTCCACTCTCCTTACG	qRT-PCR
IPI-F	gcgagcacgaaatggactac	qRT-PCR
IPI-R	GCTGCATCATCTGCCGCA	qRT-PCR
COP1-F	CGGATACAGGAGCACTTGGAT	qRT-PCR
COP1-R	GACGGCAGGTGTGTCTTGG	qRT-PCR
SPA1-F	tgccatctgatgctggct	qRT-PCR
SPA1-R	ttcggattggaatgcttgca	qRT-PCR
HY5-F	TCGGCAAAGAATGGAAAGAAGA	qRT-PCR
HY5-R	ttgtcgttgtcggaagagttg	qRT-PCR
HYH-F	ACAACAACAACAGCAACAAGTG	qRT-PCR
HYH-R	TGGTGGAGGAGAAGGAGTGA	qRT-PCR
18S-F	CAAAGCAAGCCTACGCTCT	Внутренний эталон qRT-PCR
18S-R	atacgaatgccccccgact	Внутренний эталон qRT-PCR

 

2.3 Влияние УФ-B излучения на накопление пигментов в Rhodococcus rainbowensis

Влияние УФ-В излучения на содержание хлорофилла и астаксантина в клетках Rhodococcus pyrenoidus было значительным, и это влияние зависело от интенсивности УФ-В излучения и времени обработки. Как показано на рис. 3a и 3b, содержание хлорофилла a и хлорофилла b в группе, обработанной УФ-B, было значительно ниже, чем в контрольной группе, и это снижение положительно коррелировало с интенсивностью УФ-B. В группе U100 снижение содержания хлорофилла a было меньше, чем в контрольной группе, но содержание пигмента в группе U400 было снижено на 23,34% после 24 ч обработки и на 48,75% в группе U400 через 84 ч, что было значительно больше, чем в группе U100 на 15,8%, и клеточное содержание в группе U100 на 15,8%. Содержание хлорофилла в клетках показало соотношение: контрольная группа > группа низкой интенсивности (U100 и U200) > группа средней интенсивности (U300) > группа высокой интенсивности (U400 и U500).

 

В отличие от накопления хлорофилла, астаксантин постепенно покрывал всю клетку, накопление астаксантина под действием УФ-B излучения происходило по схеме U400>U300>U200>U100>CK группа, при этом в группе U500 наблюдалось значительное снижение содержания астаксантина из-за сильного повреждения клеток через 72 ч. Содержание астаксантина в группе U300 увеличилось на 22,58% по сравнению с контролем через 24 ч, в группе U400 на 35,68% по сравнению с контролем через 36 ч, и значительно увеличилось через 72 ч, достигнув 56,23% по сравнению с группой CK, соответственно. В 24 ч содержание астаксантина в группе U300 увеличилось на 22,58% по сравнению с контрольной группой, в 36 ч содержание астаксантина в группе U400 увеличилось на 35,68% по сравнению с контрольной группой, а в 72 ч содержание астаксантина в группе U500 значительно увеличилось на 56,23% по сравнению с группой CK и достигло 5,82 и 7,06 мг/л, соответственно. После 72 ч облучения содержание астаксантина во всех группах лечения снизилось вместе с уменьшением биомассы.

 

2.4 Анализ экспрессии генов, связанных с синтезом астаксантина в Rhodococcus rainbowensis под действием УФ-B излучения

Для изучения механизма влияния УФ-В излучения на накопление астаксантина в Rhodococcus rainbowensis был проведен qRT-PCR генов IPI (изопентенил пирофосфат-изомераза), PSY (октагидрокси ликопин синтаза), BCH (β-каротин гидроксилаза) и BKT (β-каротин кетоацилаза), которые являются ключевыми ферментами первого этапа пути синтеза астаксантина, с целью количественной оценки их влияния на синтез астаксантина в Rhodococcus rainbowensis. Было обнаружено, что IPI, ключевой фермент для синтеза предшественников каротиноидов, почти не экспрессировался в контрольной группе, но был высоко экспрессирован под УФ-В излучением (P<0,05), причем экспрессия IPI была самой высокой в первый день, а затем демонстрировала тенденцию к снижению с увеличением продолжительности УФ-В излучения (Рисунок 4).

 

Экспрессия гена PSY имела тенденцию к увеличению с течением времени под воздействием УФ-В излучения, что было противоположно экспрессии гена IPI, с понижением экспрессии в первые два дня и значительным увеличением на третий день (P<0,05), и почти 90-кратным увеличением экспрессии при 400 лк УФ-В по сравнению с контрольной группой. Экспрессия гена BCH имела тенденцию к снижению и последующему увеличению как в обычных условиях культуры, так и при УФ-В облучении. По сравнению с группой CK, экспрессия гена BCH значительно увеличилась после добавления УФ-В (P<0,05), и его экспрессия достигла максимума на 3-й день, а при 400 лк УФ-В его экспрессия увеличилась почти в 310 раз по сравнению с группой CK. Экспрессия гена BKT в группе CK незначительно увеличивалась с увеличением времени, после УФ-B облучения экспрессия гена BKT была значительно выше, чем в группе CK (P<0,05), с увеличением времени экспрессия гена BKT была значительно выше, чем в группе CK (P<0,05). Экспрессия гена BKT была значительно выше, чем в группе CK после УФ-B облучения (P<0,05), и оставалась на высоком уровне с увеличением времени облучения. Экспрессия генов IPI, PSY, BCH и BKT изменялась при различной интенсивности и времени облучения. В заключение следует отметить, что по сравнению с группой CK УФ-В-облучение значительно повысило экспрессию генов, связанных с синтезом астаксантина, в Rhodococcus pyrenoidus.

 

2.5 Анализ экспрессии гена УФ-рецептора UVR8, кодируемого УФ-В-облученными Rhodococcus rainbowensis

Для изучения влияния УФ-В излучения на экспрессию гена UVR8 в Rhodococcus pyrenoidus образцы были собраны в разные временные точки и проанализированы. Как показано на рис. 5, ген UVR8 был очень чувствителен к УФ-В, и его экспрессия имела тенденцию к увеличению, а затем уменьшению с увеличением времени УФ-В облучения; по сравнению с контрольной группой, экспрессия гена UVR8 под УФ-В облучением была значительно увеличена (P<0,05), и чем выше интенсивность излучения, тем выше его экспрессия. Экспрессия гена UVR8 в группе с высокой интенсивностью излучения (U400) была примерно в 2000 раз выше, чем в группе CK в первый день, затем значительно снизилась в опытной группе на второй день, но восстановилась до более высокого уровня на третий день.

 

2.6 Анализ экспрессии ключевых генов светового сигнального пути Rhodococcus rainbowensis в условиях УФ-В излучения

Образцы водорослей были проанализированы методом qRT-PCR после 2 д УФ-B облучения (рис. 6). По сравнению с контролем, гены COP1, SPA1, HY5 и HYH были способны реагировать на УФ-B облучение, и их экспрессия изменялась на транскрипционном уровне. Экспрессия SPA1 незначительно увеличивалась при увеличении интенсивности УФ-В излучения, а экспрессия HY5 и HYH значительно увеличивалась при увеличении интенсивности УФ-В излучения, среди которых HY5 увеличивалась в 0,5 раза, а HYH - в 3,4 раза при высокой интенсивности (U400) по сравнению с низкой интенсивностью (U200). Хотя экспрессия COP1 увеличивалась под воздействием УФ-В излучения, она несколько снижалась с увеличением интенсивности УФ-В излучения.

 

3 Обсуждение

3.1 Ультрафиолетовое излучение повреждает фотосинтетическую систему Rhodococcus rainbowensis, ингибирует его рост и способствует накоплению астаксантина.

Он признан идеальным источником природного астаксантина и накапливает большое количество астаксантина в стрессовых условиях, таких как высокая освещенность и дефицит азота[15] . Предыдущие исследования показали, что УФ-B облучение соответствующей интенсивности также может эффективно индуцировать накопление астаксантина[6, 9] . Однако механизм, с помощью которого клетки водорослей воспринимают и передают сигналы УФ-В света для регулирования накопления астаксантина, не ясен. Поэтому в данной работе мы впервые исследовали изменения в росте, фотосинтетической системе и накоплении астаксантина у выращенного в дождь Rhodococcus pyrenoidus под воздействием УФ-B облучения.

 

После УФ-В облучения рост Rhodococcus rainbowensis подавлялся, и морфология клеток также изменялась: клеточная стенка постепенно утолщалась и твердела, контур становился очевидным, а зрелые покоящиеся клетки сначала формировались, а затем превращались в красные споры, накапливающие астаксантин. Это согласуется с изменениями морфологии клеток в стрессовых условиях высокой освещенности и дефицита азота [25-27], что позволяет предположить, что клетки водорослей подверглись УФ-В стрессу и отреагировали на него (рис. 1).

 

УФ-В излучение также нарушало фотосинтетическую систему Rhodococcus rainbowensis, а Fv/Fm снижалось с увеличением интенсивности УФ-В излучения, что было сходно с результатами предыдущих исследований Scenedesmus obliqnus FAC- HB 1986 и Microcystis aeruginosa [28]. Полученные результаты позволяют предположить, что УФ-В может непосредственно влиять на фотосинтетическую систему клеток водорослей, что в свою очередь влияет на поглощение световой энергии и процессы преобразования энергии, а NPQ отражает избыток световой энергии, поглощенной PSII, которая не может быть использована для фотосинтетического переноса электронов и рассеивается в виде тепла, что может быть выражено как эффективность сохранения фотосинтетической системы[29] . NPQ облученной УФ-В R. americana были ниже, чем у группы CK, что соответствует результатам группы высокой освещенности[30] , предполагая, что избыток световой энергии может быть использован для фотосинтетического переноса электронов PS II, и что NPQ R. americana были ниже, чем у группы CK, что соответствует результатам высокой освещенности[31] . Это согласуется с результатами, полученными при высоких уровнях освещенности[30], предполагая, что избыток световой энергии слишком велик для клеток водорослей, чтобы рассеиваться в виде тепла. При высокой интенсивности (300, 400 и 500 лк) УФ-B излучения фотосинтез клеток водорослей снижался независимо от продолжительности, а значения ПЭТР клеток водорослей были значительно ниже, чем в группе CK, что позволяет предположить, что в этих условиях для синтеза астаксантина может быть использовано больше световой энергии.

 

Далее мы определили изменения в накоплении астаксантина в Rhodococcus rainbowensis под действием УФ-В излучения и обнаружили, что его влияние на накопление астаксантина в клетках водорослей зависит не только от интенсивности излучения, но и от его продолжительности: низкая интенсивность (100 и 200 лк) и короткая продолжительность излучения могут увеличить содержание астаксантина в единице объема биомассы Rhodococcus rainbowensis, тогда как более высокая интенсивность (300, 400 и 500 лк) УФ-В излучения может вызвать значительное увеличение накопления астаксантина в течение короткого периода времени. Хотя УФ-В излучение более высокой интенсивности (300, 400 и 500 лк) вызывало накопление астаксантина в течение короткого периода времени, длительное воздействие УФ-В излучения наносило клеткам больше повреждений, чем они могли защитить себя, что приводило к лизису и гибели клеток и быстрому снижению содержания астаксантина (рис. 3). В заключение следует отметить, что УФ-В излучение значительно индуцировало накопление астаксантина у R. rainbowii, однако конкретный механизм регуляции был неясен.

 

3.2 Синтез астаксантина в Rhodococcus rainbowensis, индуцированный УФ-В излучением, происходит в основном на транскрипционном уровне.

В большом количестве работ показано, что светоиндуцированное накопление астаксантина у Rhodococcus pyrenoidus сопровождается различной степенью высокой экспрессии генов, связанных с синтезом астаксантина, на транскрипционном уровне [6, 9, 15], что позволяет предположить, что механизм регуляции частично происходит на транскрипционном уровне. Поэтому для изучения взаимосвязи между регуляцией генов синтеза астаксантина и накоплением астаксантина экспрессия генов, связанных с биосинтезом астаксантина, была исследована методом qRT-PCR при различных интенсивностях облучения (200 и 400 лк) и длительности (24 ч, 48 ч и 72 ч), и результаты показали, что транскрипционная экспрессия ключевых генов, таких как IPI, PSY, BCH и BKT, значительно различалась в зависимости от интенсивности облучения. Результаты показали, что экспрессия ключевых генов, таких как IPI, PSY, BCH и BKT, значительно различалась при различных интенсивностях излучения (рис. 4), что соответствует тенденции высокой экспрессии ключевых генов для синтеза астаксантина в Rhodococcus rainbowensis после обработки ACC (1 -Aminocyclopropane- 1 - AarboxylicAcid)[31], синего света и белого света[24], как сообщается в литературе. В заключение следует отметить, что УФ-В является индуцирующим фактором в сети биосинтеза астаксантина, а экспрессия генов, связанных с синтезом астаксантина (IPI, PSY, BCH и BKT), коррелировала с интенсивностью и продолжительностью УФ-В излучения.

 

3.3 Сигнальные пути, опосредованные УФ-В, могут быть индуцированы УФ-В в

Хотя вызванное УФ-В излучением накопление астаксантина в R. rainieri происходит в основном на транскрипционном уровне, неясно, как клетки водорослей воспринимают и передают УФ-В сигналы, и как они активируют высокую транскрипционную экспрессию генов, связанных с синтезом астаксантина.

 

Растения полагаются на фоторецепторы, такие как ультрафиолетовый фоторецептор UVR8 (UV resistance locus 8), которые чувствуют световые сигналы через конформационные изменения и фосфорилирование, и формируют сложную рецепторно-трансдукторную систему через множество взаимодействующих белков, которые соединяются с другими путями передачи сигнала в организме, а затем регулируют экспрессию генов, и в конечном итоге регулируют физиологические процессы светового ответа [10-15]. 15]. Мономеризация UVR8, который связывается с COP1 и SPA1, активирует транскрипционный фактор HY5 через сосуществование множества механизмов. HY5 находится в центре сети трансдукции светового сигнала и может индуцировать экспрессию ряда фотоморфогенных генов, включая свой когнат HYH, в ответ на сигналы UV-B [32], такие как ингибирование удлинения гипокотиля горчицы, стимулирование накопления пигмента и усиление устойчивости к свету [33]. UVR8-COP8 также является ключевым компонентом UVR8-COP8, который способствует накоплению пигмента и повышает устойчивость к стрессу [17, 33]. Между тем, эволюционно сохранился путь UVR8-COP1, который опосредует ответ на УФ-В в Chlamydomonas rein- hardtii и защищает фотосинтетическую систему клеток Chlamydomonas rein- hardtii, запуская механизм нефотохимического тушения [34].

 

В прошлом наша лаборатория получила последовательность генов, кодирующих УФ-рецептор UVR8 из Rhodococcus pyrenoidus[16], но зависит ли УФ-B реакция в Rhodococcus pyrenoidus от фоторецептора UVR8, не ясно. Недавний прогресс в изучении механизма УФ-В сигнализации у Arabidopsis thaliana и Chlamydomonas reinhardtii открывает перспективы для анализа УФ-В пути у Rhodococcus pyrenoidosus. Мы исследовали гены, связанные с УФ-В сигнальным путем (UVR8, COP1, SPA1, HY5, HYH) на уровне транскрипции генов, и результаты qRT-ПЦР показали, что не только УФ-рецептор UVR8, но и УФ-рецептор UVR8 значительно пострадали при высокой интенсивности УФ-В излучения, но и УФ-рецептор UVR8 был значительно пострадал при высокой интенсивности УФ-В излучения. Результаты qRT-PCR показали, что после УФ-B облучения не только УФ-рецептор UVR8 значительно повышался при высокой интенсивности УФ-B, но и гены, связанные с сигнальным путем УФ-B (COP1, SPA1, HY5 и HYH), играли роль в транскрипционной регуляции. Это позволяет предположить, что вышеуказанные гены сигнального пути УФ-В играют важную роль в накоплении астаксантина в Rhodococcus rainbowensis.

 

Объединив результаты настоящего исследования с данными предыдущих исследователей [21, 24, 31], мы предположили, что в R. amurentica также существует механизм "световой сигнал→фоторецептор→взаимодействующие белки (взаимодействующие белки→транскрипционные факторы/транскрипционные регуляторы)→экспрессия функциональных генов→накопление шруббербереллина" в ответ на УФ-В сигналы и активацию соответствующих путей. Как показано на рис. 7, было установлено, что такие гены, как UVR8, COP1, SPA1, HY5 и HYH, были повышены под действием УФ-В излучения, а гены ключевых ферментов синтеза астаксантина (IPI, PSY, BCH и BKT) также высоко экспрессировались под действием УФ-В, синхронно с высокой экспрессией генов светового сигнального пути. Однако экспериментальных доказательств того, что UVR8, фоторецептор Rhodococcus rainbowensis, участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом астаксантина, путем прямого взаимодействия с белками и транскрипционными факторами, связанными со световым сигнальным путем, и таким образом способствует обогащению астаксантина, нет, что требует дальнейшего изучения. Настоящая работа дает новую идею для анализа механизма светоиндуцированного накопления астаксантина в Rhodococcus pyrenoidus, и необходимо продолжить поиск новых доказательств для дальнейшего анализа механизма транскрипционной регуляции светоиндуцированного синтеза астаксантина.

 

Ссылки.

[ 1] Li X Y, Zhan Y G, Lou X R, et al. Анализ последовательности и экспрессии гена BpUVR8 в березе [J] . Физиология растений Журнал Физиология растений, 2016, 52(5): 685- 692.

[2] Ren H, Huang X. Прогресс в исследованиях по регулированию роста и развития растений ультрафиолетовым светом B [J]. Журнал Сямыньского университета (естественные науки), 2021, 60(2): 327-338.

[3] Wargent, J J, Gegas V C, Jenkins G I, et al. UVR8 в Ara- bidopsis thaliana регулирует многочисленные аспекты клеточной диф- ференциации во время развития листьев. в ответ на ультрафиолетовое излучение B [J]. New Phytologist, 2009, 183(2): 315-326.

[4] Fasano, R, Gonzalez N, Tosco A, et al. Роль локуса 8 устойчивости к УФ-излучению арабидопсиса в снижении роста растений в условиях осмотического стресса и низкого уровня УФ-В [J ]. Molecular Plant, 2014, 7(5): 773-791.

[5] Yang P Y. The functional analysis of Arabidopsis UV-B photoreceptor UVR8 [D]. Changsha: Hunan Normal Uni- versity, 2016: 36-41  

[6] Jiang X M, Zhai X W, Wang L, et al. Физиологическая ада- птация и изменение ультраструктуры Haematococcus plu- vialis под воздействием ультрафиолетового излучения [J]. Journal ofFish- ing of China, 2003, 27(2): 105-112.

[7] Wang Q, Zuo Z, Wang X, et al. Photoactivation and inac- tivation of Arabidopsis cryptochrome 2 [J] . Science, 2016, 354(6310): 343-347.

[8] Yin R H. Ulm R How plants cope with UV-B: from per- ception to response [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2017(37): 42-48.

[9] Xiao Y, Wang G H, Liu Y D. Влияние УФ-B на фотосинтетические свойства и накопление астаксантина Haematococcus pluvialis и его ответные реакции [J]. Acta Hy- drobiologica Sinica, 2010, 34(6): 1077-1082.

[ 10] Christie J M, Arvai A S, Katherine J, et al. Plant UVR8 photoreceptor senses UV-B by tryptophan-mediated dis- ruption of cross-dimer salt bridges [J]. .  Science , 2012(335): 1492-1496.

[ 11] Wu D, Hu Q, Yan Z, et al. Structural basis of ultraviolet- B perception by UVR8 [J] . Nature, 2012, 484(7393): 214-219.

[ 12] Morales L O, Brosche M, Vainonen J, et al. Multiple roles for UV resistance locus 8 in regulating gene expres- sion and metabolite accumulation in Arabidopsis под воздействием солнечной ультрафиолетовой радиации [J]. Физиология растений, 2013, 161(2): 744-759.

[ 13] Al-Sady B, Kikis E A, Monte E, et al. Mechanistic dua- lity of transcription factor function in phytochrome sig- naling [J]. Proceedings of the National Academy of Sci- ences of the United States of America, 2008(105): 2232-

2237.

[ 14] Park E, Kim Y, Choi G. Phytochrome B требует PIF де-градации и секвестрации, чтобы вызвать световые реакции в широком диапазоне условий освещения [J]. . The Plant Cell, 2018, 30(6): 1277-1292.

[ 15] Yu Y, Liu H T. Скоординированные ответы побега и корня на световую сигнализацию в Arabidopsis [J]. Plant Communications, 2020, 1(2): 10026.

[ 16] Zhang H J, Hang W, Ma H T, et al. Клонирование генов и биоинформационный анализ нового локуса 8 (UVR8) устойчивости к ультрафиолету-B фоторецептора из зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [J. зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2019, 32(9): 2025-2032.

[ 17] Rizzini L, Favory J J, Cloix C, et al. Восприятие УФ-B белком UVR8 арабидопсиса [J] . Science, 2011, 332(6025): 103-106.

[ 18] Oravecz A, Baumann A, Z Mate, et al. Constitutively photomorphogenic1 is required for the UV-B response in Arabidopsis [J]. Plant Cell, 2006, 18(8): 1975-1990.

[ 19] Lau O S, Deng X W. The photomorphogenic repressors COP1 and DET1: 20 years later [J]. Trends in Plant Sci- ence, 2012, 17(10): 584-593.

[20] Lin R C, Wang H Y. Нацеливание белков на деградацию с помощью Arabidopsis COP1: командная работа - вот что важно [J]. Журнал интегративной биологии растений, 2007, 49(1): 35-42.

[21] Ли Х С. Принципы и методы физиолого-биохимического эксперимента растений [М]. Пекин: Издательство высшего образования, 2000: 167-169.

[22] Boussiba S, Vonshak A. Накопление астаксантина в зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [J]. Физиология растений и клеток, 1991, 32(10): 77-82.

[23] Gao Z Q, Meng C X, Zhang X W, et al. Индукция салициловой кислоты (SA) на транскрипционную экспрессию восьми каротиноидных генов и астаксантин Индукция сали-циловой кислоты (SA) на транскрипционную экспрессию восьми каротиноидных генов и накопление астаксантина в Haematococcus pluvialis [J] . Ферментные и микробные технологии, 2012, 51(4): 225-230.

[24] Cui H L, Xu W X, Cui Y L, et al. Transcriptome analysis of signal transduction pathway involved in light inducing astaxanthin accumulation in. Haematococcus pluvialis [J]. Китайский журнал биотехнологии, 2020, 37(7): 1-17.

[25] Zhang C H. Исследование метаболической регуляции накопления энан- цингастаксантина в Haematococcus pluvia- lis [D] .  Циндао: Институт океанологии Китайской академии наук, 2019: 27-34.

[26] Han D X, Wang J F, Sommerfeld M, et al. Susceptibility and protective mechanisms of motile and non motile cells of Haematococcus pluvialis ( Chlorophyceae) к фотоокси-дативному стрессу [J]. Journal of Phycology, 2012, 483(3): 693-

705.

[27] Li Y T, Sommerfeld M, Chen F, et al. Потребление кислорода при биосинтезе астаксантина: защитный механизм против окислительного стресса в Haematococcus pluvia- lis (Chlorophyceae) [J] . Journal of Plant Physiology, 2008, 165(17): 1783-1797.

[28] Li S, Tao Y, Dao G H, et al. Эффект подавления роста УФ-С облучения на Scenedesmus obliquus в рекультивированной воде [J]. Экологическая инженерия, 2020, 38(10): 97- 102, 113.

[29] Wang B B. Механизмы фотозащиты и перекрестное взаимодействие между биосинтезом жирных кислот и астаксантина в Haematococcus pluvialis [D] . Xiamen: Xiamen Uni- versity, 2014: 67-71.

[30] Zhu C, Chen J, Liu J H, et al. Transcriptomic and meta- bolic analysis of an astaxanthin hyperproducing Haematococcus pluvialis mutant obtained by мутанта Haematococcus pluvialis, полученного путем мутагенеза в низкотемпературной плазме (LTP) при освещении [J]. Algal Research, 2020(45): 101746.

[31] Lee C, Choi Y E, Yun Y S. Corrigendum to "A Strategy for promoting astaxanthin accumulation in Haematococ-cus pluvialis by 1- аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты" [J]. Журнал биотехнологии, 2016(236): 120-127.

[32] Fernández M B, Tossi V, Lamattina L, et al. A compre- hensive phylogeny reveals functional conservation of the UV-B photoreceptor UVR8 from green algae to higher plants [J]. от зеленых водорослей к высшим растениям [J]. Frontiers in Plant Science, 2016(7): 1698.

[33] Huang X, Ouyang X, Yang P, et al. Преобразование из CUL4-базированного COP1-SPA E3 аппарата в UVR8-COP1- SPA комплексы лежит в основе отдельной биохимической функции COP1 под воздействием УФ-B [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(41): 16669-16674.

[34] Tilbrook K, Dubois M, Crocco C D, et al. UV-B percep- tion and acclimation in Chlamydomonas reinhardtii [J]. Plant Cell, 2016, 28(4): 966-983.