Извлечение и характеристика астаксантина из различных частей южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei)

 Южноамериканская белая креветка (Litopenaeus vannamei), научно известная как креветка Ванабина, относится к членистоногим филума Crustacea, Decapoda, Natantia, Penaeidae, Paneaus и подроду Litopenaeus[1-2] . Подрод Litopenaeus[1-2]. Южноамериканская белая креветка отличается быстрым темпом роста и длительным репродуктивным циклом, и вместе с китайской креветкой и пятнистыми креветками известна как самый высокий в мире объем производства трех основных видов культивируемых креветок, а также более крупный объем производства одного из видов культивируемых креветок.

Южноамериканская белая креветка обладает высокой питательной ценностью, содержит до 90 процентов белка в сухом виде и всего 1 процент жира, а также богата различными минеральными веществами[2-3] . Астаксантин (astaxanthin), молекулярная формула C40 H52 O4, химическое название 3,3'-дигидрокси-4,4'-дикето-β , β '-каротин, содержится во многих водных растениях. Каротин, присутствующий во многих водных животных[4] . Помимо сильных антиоксидантных свойств, астаксантин обладает антиканцерогенной и иммуноукрепляющей активностью[5] . Астаксантин природного происхождения можно получить из Rhodococcus pyrenoidus и дрожжей Файфа, а панцири и головы креветок, которые являются побочными продуктами переработки креветок, также содержат астаксантин[6] . Однако о распределении астаксантина в панцирях, головах и мясе креветок не сообщалось. Поэтому в данном исследовании сравнивалось влияние встряхивания на водяной бане и ультразвуковой экстракции на извлечение астаксантина из креветочной пасты, панцирей и мяса креветок, а также анализировалось относительное содержание свободного и эфирного астаксантина в экстрактах астаксантина с целью заложить основу для комплексного извлечения астаксантина из креветок, а также для последующего изучения активности астаксантина в белых южноамериканских креветках.

 

1 Материалы и методы

1.1 Основные материалы  

Белые креветки были приобретены в супермаркете China Resources Vanguard, район Динхай, город Чжоушань; безводный этанол был аналитически чистым и приобретен в Sinopharm; дихлорметан, метанол и ацетонитрил были хроматографически чистыми и приобретены в Shanghai Aladdin Biochemical Science and Technology Co.

 

1.2 Методы испытаний

1.2.1 Экстракция астаксантина

Замороженные южноамериканские белые креветки размораживались в проточной воде, панцири и паста креветок очищались вручную, панцири и паста креветок пропаривались в пароварке в течение 3 минут до покраснения, а мясо креветок пропаривалось в пароварке в течение 5 минут до покраснения мяса. Панцири и мясо креветок были разломаны по отдельности, а мясо креветок удалено.

2 г добавляли к 10 мл безводного этанола в соотношении 1:5 (m:V), панцири и мясо креветок экстрагировали встряхиванием на водяной бане (37 ℃, 1 ч) и ультразвуковой экстракцией (37 ℃, 1 ч), а креветочную пасту экстрагировали только встряхиванием на водяной бане (37 ℃, 1 ч). Смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин, а надосадочную жидкость разбавляли безводным этанолом до полного растворения.

15 мл, отстаивают. После 1 экстракции панцири креветок, креветочную пасту и остатки мяса креветок продолжают экстрагировать 2 раза при тех же условиях, надосадочную жидкость фиксируют до 15 мл и отставляют в сторону.

 

1.2.2 Определение общего содержания астаксантина

UV-Vis спектры креветочной пасты, креветочного панциря и мякоти креветок, экстрагированных встряхиванием на водяной бане и ультразвуком в течение одного раза, сканировались при 200-800 нм для определения характерных длин волн поглощения. Приготовьте 100 мкг/мл стандартного резервного раствора астаксантина путем определения 10 мг стандартного астаксантина в безводном этаноле в коричневой волюметрической колбе объемом 100 мл. Разбавьте стандартный резервный раствор безводным этанолом до 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 16,0, 32,0 мкг/мл раствора астаксантина, обнулите раствор безводным этанолом, а затем измерьте поглощение на характерной длине волны, чтобы построить стандартную кривую астаксантина.

 

1.2.3 Определение свободных и сложных астаксантинов

Для анализа содержания свободного и сложного астаксантина в панцирях и мясе креветок использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)[7]. Метод был следующим: Agilent 1260 HPLC, ZORBAX SB-C18, ZORBAX SB-C18 и ZORBAX SB-C18.

（Разделение проводилось на колонке 4,6 мм×250 мм (5 мкм) при 25 ℃ с объемом впрыска 10 мкл и скоростью потока 1 мл/мин. Разделение проводилось на 100% подвижной фазе A (дихлорметан ∶ метанол ∶ ацетонитрил ∶ вода = 5∶85∶5,5∶4,5) в течение 0~10 мин, и на 100% подвижной фазе B (дихлорметан ∶ метанол ∶ ацетонитрил ∶ вода = 22∶28∶45,5∶4,5) в течение 11~35 мин. 45.5 ∶ 4.5). Стандартный астаксантин (32 мкг/мл) элюировали в тех же условиях.

 

1.3 Статистический анализ данных  

Результаты выражали в виде среднего ± стандартное отклонение (n = 3) и сравнивали значимые различия между группами с помощью программы SPSS 19.0 (P<0,05). Для построения графиков использовалась программа Origin 2019.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние метода экстракции и количества экстракций на извлечение астаксантина из южноамериканской белой креветки Penaeus vannamei.

2.1.1 Результаты УФ-видимого спектрального сканирования. Астаксантин был извлечен из креветочной пасты, панциря креветки и мяса креветки с помощью встряхивания на водяной бане при 37 ℃ и ультразвука при 37 ℃ соответственно, а УФ-Vis спектры экстрактов показаны на рис. 1. Как показано на рис. 1, характерные пики поглощения экстрактов астаксантина из различных частей креветок были обнаружены при 477 нм, что соответствует результатам, полученным Ян Ся и др[8] . Кроме того, пики поглощения экстрактов астаксантина из разных частей креветки появлялись при 220 и 280 нм, которые были связаны с белками, пептидами или аминокислотами, предположительно из-за присутствия определенного количества воды в экстракционной системе (креветка сама по себе имеет высокое содержание воды), в результате чего одновременно экстрагировались водорастворимые или гидрофобные белки, пептиды или аминокислоты.

 

Рис.1 УФ-видимое сканирование экстрактов астаксантина из различных частей южноамериканской белой креветки Рис.1 УФ-видимое сканирование экстрактов асты из L. vannamei dif-.

разные части

 

2.1.2 Влияние методов экстракции на общее содержание астаксантина в панцирях, пасте и мясе креветок.

Как видно из рис. 2, стандартная кривая астаксантина имеет вид y = 0,097x + 0,010 8 (R2 = 0,992 6), что свидетельствует о хорошей линейной зависимости астаксантина в диапазоне 0 ~ 10 мкг/мл, и может быть использована для определения общего количества астаксантина в экстракте.

Рис.2 Стандартная кривая асты

Сравнение содержания астаксантина в креветочной пасте, панцире и мясе, экстрагированных встряхиванием на водяной бане и ультразвуком (рис. 3), показало, что наибольшее содержание астаксантина было обнаружено в креветочной пасте, экстрагированной встряхиванием на водяной бане (595,85 ± 53,21 мкг/г), затем в панцире креветки (168,64 ± 33,54 мкг/г), а наименьшее - в мясе креветки (49,82 ± 19,96 мкг/г). Ультразвук обладает хорошим эффектом разрушения стенок, однако содержание астаксантина в панцирях и мясе креветок, извлеченных ультразвуком, составило (157. 11 ± 17. 09) и (31.93 ± 6.27) мкг/г соответственно, что существенно не отличалось от такового при извлечении методом осцилляции на водяной бане (P>0.05).

 

Примечание: Разные строчные буквы указывают на значительные различия (P < 0,05)

Рис.3 Сравнение общего содержания асты, извлеченной различными

методы из различных частей L. vannamei

 

2.1.3 Влияние количества экстракций на содержание общего астаксантина в креветочной пасте, панцирях и мясе.

Далее было исследовано влияние встряхивания на водяной бане и ультразвуковой экстракции на извлечение астаксантина из креветочной пасты, панцирей и мяса, результаты представлены на рис. 4. Как видно из рис. 4, содержание астаксантина в креветочной пасте, экстрагированной встряхиванием на водяной бане три раза, составило (52,01 ± 16,41) мкг/г, что было значительно ниже, чем в креветочной пасте, экстрагированной один раз и два раза (P < 0,05). При встряхивании на водяной бане содержание астаксантина в панцирях креветок достигло (101,59 ± 3,52) мкг/г после одной экстракции, что было значительно выше, чем в панцирях креветок (44,12 ± 15,49 мкг/г) после двух экстракций (P < 0,05), тогда как астаксантин в мясе креветок был в основном полностью извлечен после одной экстракции. Под действием ультразвукового разрушения стенок не было обнаружено существенной разницы в содержании астаксантина в панцирях креветок после двух экстракций (P>0,05), а астаксантин в мясе креветок также был полностью извлечен после одной экстракции. Однако стоит отметить, что общее содержание астаксантина в панцирях креветок, экстрагированных ультразвуком (159,79 мкг/г), было ниже, чем в панцирях креветок, экстрагированных встряхиванием на водяной бане (179,10 мкг/г). Молекулы астаксантина имеют полиненасыщенную структуру и подвержены деградации под воздействием света, тепла и кислорода[5, 9] . Было обнаружено, что ультразвук разрушает весь транс-астаксантин до бесцветного неизвестного вещества, и эта деградация усиливается с увеличением мощности и времени ультразвука[9] . Снижение общего содержания астаксантина после ультразвуковой экстракции панцирей и мяса креветок на рис. 4 связано с деградацией части астаксантина под действием ультразвука.

 

2.2 Сравнение содержания свободного и эфирного астаксантина в различных частях южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei)  

Распределение свободного и сложного астаксантина в креветочной пасте, панцире и мясе, извлеченных методом встряхивания на водяной бане, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), результаты представлены на рис. 5. Из рис. 5 видно, что вблизи 8 мин наблюдается характерный пик поглощения стандарта астаксантина (свободного типа), и на основании квалификации времени элюирования можно сделать вывод, что свободный астаксантин содержится в креветочной пасте, панцире и мясе, извлеченных методом встряхивания на водяной бане. Гидроксильная группа на шестичленном кольце астаксантина может соединяться с жирными кислотами, образуя эфиры жирных кислот астаксантина[8, 10] . Эфиры астаксантина также имеют характерное поглощение в районе 477 нм, но поскольку они более гидрофобны, чем свободный астаксантин, время элюирования увеличивается, а время пика наступает позже. В соответствии с литературными данными[7], можно предположить, что пики продолжительностью 28-40 минут на рис. 5 должны представлять собой астаксантин эфирного типа. Интегрируя площади пиков, относительное содержание свободного и сложноэфирного астаксантина в креветочной пасте составило 38% и 62%, соответственно, а относительное содержание свободного и сложноэфирного астаксантина в креветочных панцирях было близко к относительному содержанию свободного астаксантина в креветочном мясе и достигало 60%. Видно, что наличие астаксантина в креветочной пасте, панцирях креветок и мясе креветок южноамериканской белой креветки в виде различных, свободных и эфирных астаксантинов в креветочной пасте, панцирях креветок и мясе креветок южноамериканской белой креветки в соотношении 2:3, 1:1 и 3:2, соответственно.

 

3 Заключение

Астаксантин из южноамериканских белых креветок имел типичный пик поглощения при 477 нм, а общее количество астаксантина, извлеченного при встряхивании на водяной бане, было выше, чем при ультразвуковой экстракции. Астаксантин свободного и эфирного типа был обнаружен в креветочной пасте, панцире и мясе, но в пасте преобладал астаксантин эфирного типа, в панцире астаксантин свободного и эфирного типа был близок друг к другу, а в мясе преобладал астаксантин свободного типа. Таким образом, в разных частях южноамериканской белой креветки состав астаксантина различен.

 

Ссылки:

[1] Wei Zhenna. Использование источников растительного белка Penaeus vannamei[D] . Чжаньцзян: Гуандунский океанический университет, 2010.

[2] Cai Shengli. Последние исследования и прогресс в аквакультуре креветок - Третий всемирный симпозиум по китайской аквакультуре креветок.

[3] CHEN Qin , CHEN Xiaohan , XIE Daxiang , et al. Содержание мякоти южноамериканской белой креветки (Litopenaeus vannamei), выращенной при различной солености, и ее мышечная масса.

[4] []Red. ,,Sub(ti:11. Исследование его свойств[D] . Пекин: Китайский сельскохозяйственный университет, 2006.

[5] HIGUERA-CIAPARA I , FÉLIX-VALENZUELA L , GOYCOOLEA F M. Astaxanthin: A review of its chemistry and applications [J] .Critical reviews

[6] io,siee, ,ntrnan iti,shrimp,4() в:1. процесс экстракции и стабильность

[J] . China Fisheries Quality and Standard ,2014 ,4(1) :43-52.астаксантин-эфир-продуцирующий штамм микроводоросли Haematococcus pluvialis[J] .Food chemistry ,2000 , 68(4) :443-448.

[8] YANG Xia, ZHANG Zhisheng, ZHENG Qianwei, et al. Оптимизация сверхкритической СО2-экстракции астаксантина из южноамериканской белой креветки Penaeus vannamei.

 

Каков молекулярно-видовой состав астаксантина в жире антарктического криля?

 Масло антарктического криля добывают из антарктического криля в качестве сырья для получения сложных функциональных липидных продуктов [1], обладающих липидопонижающим [2], противовоспалительным [3], улучшающим обучаемость и когнитивные способности [4] и другими эффектами. Одно из важных функциональных сопровождений - астаксантин придает маслу антарктического криля уникальный глубокий красный цвет, известный как "морской рубин", потенциал развития и применения которого очень велик[5] . Исследования показали, что астаксантин обладает отличной антиоксидантной активностью, его антиоксидантная способность более чем в 10 раз превышает таковую других каротиноидов (таких как зеаксантин, лютеин, ликопин, β-каротин) и более чем в 100 раз - α-токоферола[6].

Содержание астаксантина в масле антарктического криля колеблется в пределах 40-5000 мг/кг, и его содержание в основном зависит от сырья криля, методов добычи, очистки и рафинации [7-9]. В настоящее время экстракция масла криля из антарктического криля органическими растворителями получила широкое распространение и широко используется в промышленности благодаря низкой стоимости и простоте процесса [10]. Однако в большинстве существующих исследований о выходе масла криля как показателе оптимизации условий процесса, о выборе растворителя для экстракции масла антарктического криля, богатого астаксантином и фосфолипидами, сообщалось редко.

 

Биодоступность, указывающая на максимальное количество активного ингредиента, которое может высвободиться из пищи и всосаться в клетки кишечника, является важным показателем для оценки биологической эффективности функционального фактора [11]. Астаксантин, являясь жирорастворимым каротиноидом, ключевым фактором его биоактивности после приема внутрь является доля каротиноида, которая всасывается и утилизируется или накапливается в организме. Исследования показали, что на биодоступность каротиноидов влияют молекулярная структура, физическое связывание в пище, содержание жира в рационе, а также количество ферментов поджелудочной железы и желчных солей в желудочно-кишечном тракте [12]. Молекулярный состав астаксантина в антарктическом криле сложен и разнообразен, он богат фосфолипидами, полиненасыщенными жирными кислотами и другими липидными компонентами [13]. В настоящее время не хватает интуитивных и систематических данных исследований, позволяющих выяснить процесс переваривания и усвоения астаксантина в масле антарктического криля. Поэтому важно изучить процесс переваривания и усвоения астаксантина в масле криля на модельных животных на основе выбора растворителя для экстракции богатого астаксантином масла криля и состава молекулярных видов, что имеет большое значение для развития применения масла криля.

В итоге, в данном эксперименте путем измерения и анализа содержания астаксантина, содержания фосфолипидов и выхода крилевого масла и других показателей, проведено комплексное исследование влияния различных систем растворителей на экстракцию крилевого масла, определены предпочтительные условия системы; а затем дана качественная и количественная характеристика состава молекул астаксантина в крилевом масле, приготовленном в условиях предпочтительной системы; и выбраны мыши ICR в качестве тестовой модели для изучения астаксантина в масле антарктического криля в организме на предмет переваривания, выведения и биоаккумулируемости. Переваривание, выведение и биологическая приемлемость астаксантина в масле антарктического криля были исследованы на мышах ICR в качестве тестовой модели с целью предоставления данных в поддержку научного применения масла антарктического криля в функциональных продуктах питания.

 

1 Материалы и методы

1.1 Материалы и инструменты

Мыши-самцы SPF класса ICR весом 20~25 г, Beijing Viton Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd (лицензия №: SCXK (Beijing) 2016-0011), свободно пили и ели до начала эксперимента, адаптивное выращивание в течение одной недели; порошок антарктического криля предоставлен Shandong Cinya Bio-technology Co. Ltd.; стандартный продукт антарктического астаксантина (all-trans-astxanthin) с чистотой 95,8%±0,5%, Dr. Ehrenstorfer GmbH, Германия; метил третичный бутиловый эфир (MBTE), Dr. Ehrenstorfer GmbH, Германия.

Хроматографическая чистота, Burdick & Jackson; хроматографическая чистота метанола, Merck, Германия; безводный этанол, ацетон, хлороформ, н-гексан, аналитическая чистота, Sinopharm; кукурузное масло (жирнокислотный состав: 15 масс. % насыщенных жирных кислот, 30,8 масс. % мононенасыщенных жирных кислот, 54,1 масс. % полиненасыщенных жирных кислот), Shandong Xiwang Foods Co. Корм

Пекинская компания Beijing Ke'ao Hip Lik Feed Co.

 

Колонка YMC-Carotenoid-C30 (4,6 мм×250 мм, 5 мкм) YMC Corporation, Япония; очиститель воды Millipore Q Corporation, США; моторизованный высокоскоростной гомогенизатор MS 3B-S25.

IKA (Германия); HH-4 Цифровая термостатическая водяная баня Guohua Electric Appliance Co. Associates; UV-800PC-DS2 UV-Vis спектрофотометр Shanghai Meppan Delta Instruments Co. 300E Ультразвуковой очиститель Kunshan Ultrasonic Instrument Co.

 

1.2 Экспериментальные методы

1.2.1 Процесс добычи масла антарктического криля   

В результате предварительного тестирования метод экстракции масла антарктического криля был определен следующим образом: 100,00 г (с точностью до 0,01 г) порошка креветок антарктического криля были точно взвешены в треугольной колбе, добавлено 2000 мл растворителя для экстракции, экстракция проводилась с помощью ультразвуковой экстракции в условиях ледяной бани (0 ℃) в течение 90 минут, затем в конце экстракции раствор был отфильтрован, и раствор был сконцентрирован ротационным выпариванием и вакуумом до полного отсутствия растворителя, после чего было получено масло антарктического криля.

 

1.2.2 Влияние различных экстракционных растворителей на эффект экстракции масла антарктического криля

Согласно п. 1.2.1 метода экстракции масла антарктического криля, в качестве растворителей для получения масла были выбраны 95% этанол-вода, безводный этанол, 10% н-гексан-этанол, 20% н-гексан-этанол, 40% н-гексан-этанол, 60% н-гексан-этанол, 80% н-гексан-этанол и н-гексан, соответственно. Были определены общее содержание астаксантина и фосфолипидов, а также выход креветочного масла.

 

1.2.2.1 Определение общего содержания астаксантина в образцах   

По данным Zhou et al. [14], общее содержание астаксантина может быть рассчитано путем измерения поглощения растворов различных образцов при 489 нм. Конкретный метод определения: взвешивают 15,00 мг (с точностью до 0,01 мг) образца масла антарктического криля, помещают в стеклянную центрифужную пробирку с градуированной пробкой, добавляют в центрифужную пробирку смесь диметилсульфоксида и уксусной кислоты (отмеряют 2,5 мл раствора уксусной кислоты и добавляют его к 100 мл раствора диметилсульфоксида, чтобы получить смесь диметилсульфоксида и уксусной кислоты) 2 мл, хорошо взбалтывают, затем взбалтывают при 70 ℃ в условиях водяной бани и выдерживают в течение 5 минут. После встряхивания раствор встряхивали и выдерживали при 70 ℃ в течение 5 минут, затем жидкость переносили в объемную колбу на 100 мл, а смешанный раствор диметилсульфоксида и уксусной кислоты использовали для определения значения абсорбции при 489 нм, которое записывали как А. Холостой образец был изготовлен с использованием смешанного раствора диметилсульфоксида и уксусной кислоты. Общее содержание астаксантина в образце рассчитывали по формуле (1).

 

1.2.3 Молекулярно-видовой состав астаксантина в масле антарктического криля   

Общий астаксантин в масле антарктического криля получали и очищали по методу, описанному в литературе [14]. 100,00 мг масла антарктического криля, приготовленного в предпочтительных условиях, взвешивали (с точностью до 0,01 мг), растворяли в 5 мл гексана и очищали с помощью активированной н-гексаном нормально-фазной силикагелевой колонки SEP-PAK. Возьмите 1 мл растворенного раствора в качестве образца, элюируйте и очистите его гексаном/ацетоном (100/0→95/5→90/10→0/100, V/V), определите элюированные компоненты с помощью тонкослойной хроматографии (ТЛХ) и ВЭЖХ, затем соберите и объедините элюаты бис(эфира) астаксантина, моно(эфира) астаксантина и свободного астаксантина, а затем повторно растворите их в ацетоне после продувки азотом, чтобы получить общий раствор астаксантина после очистки. Очищенный общий раствор астаксантина фильтровали через мембрану 0,22 мкм, а молекулярный состав астаксантина анализировали качественно и количественно методом ВЭЖХ-МС.

 

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза A: метанол; подвижная фаза B: метил-трет-бутиловый эфир; линейное градиентное элюирование: 0-15 мин: 0% B; 15-22 мин: B увеличивается от 0% до 22%; 22-48 мин: B поддерживается на уровне 22%; 48-56 мин: B увеличивается от 22% до 40%; 56-76 мин: 40%. Скорость потока составляла 1,0 мл/мин; длина волны обнаружения - 476 нм; температура колонки - 35 ℃; полный диапазон сканирования длины волны DAD - 200-800 нм; объем инжекции - 20 мкл. Условия МС: основные параметры масс-спектрометрии были оптимизированы, и диапазон сканирования масс на первой стадии масс-спектрометрии был определен как m/z 300-1400 для источника APCI, режим положительных ионов, давление распыляющего газа - 60 psi; Скорость потока сухого газа (N2) составляла 5 л/мин, температура сухого газа составляла 350 ℃, а температура источника ионов составляла 450 ℃. Давление в капилляре составляло 3,7 кВ, ток коронного разряда - 4 мкА. Вторичная масс-спектрометрия проводилась в режимах сканирования родительских ионов и дочерних ионов, с напряжением фрагментации 100 В, энергией удара 25 эВ и диапазоном сканирования масс 100~1500 м/z. Масс-спектральные данные обрабатывались программой Mass Hunter, которая использовала функцию деконволюции (алгоритм извлечения молекулярных символов) для извлечения хроматографических пиков и их обработки.

 

1.2.4 Определение переваривания и всасывания астаксантина в масле антарктического криля у мышей

1.2.4.1 Приготовление раствора для гаважа масла антарктического криля    

Определенное количество (0,01 мг) масла антарктического криля точно взвешивали и диспергировали в соответствующем количестве кукурузного масла, которое встряхивали ультразвуком в течение 5 минут под защитой ледяной бани и газа азота, чтобы оно хорошо диспергировалось, а затем готовили желудочный раствор масла антарктического криля с кукурузным маслом в концентрациях 10, 30 и 50 мг/мл, в соответствии с дозировкой и объемом гаважа, установленными в последующих экспериментах, соответственно.

 

1.2.4.2 Экскреция астаксантина в фекалиях мышей    

Подопытные мыши были случайным образом разделены на две группы в зависимости от массы тела: группа масла антарктического криля и контрольная группа, по шесть мышей в каждой группе. Мышей в группе с маслом антарктического криля кормили кормом и водой ad libitum в течение одной недели, перед экспериментом их постили в течение 10 часов, а мышей в группе с маслом антарктического криля лечили маслом антарктического криля в дозе 300 мг/кг массы тела и дозе 1,5 мг/кг массы тела.

Эквивалентная доза астаксантина составляла 0,078 мг/кг массы тела в объеме 10 мл/кг массы тела. Для изучения того, влияет ли кормление антарктическим крилевым маслом на фекалии подопытных мышей, что, в свою очередь, влияет на выведение астаксантина, была создана контрольная группа, которой вводили кукурузное масло в объеме 10 мл/кг массы тела. Контрольную группу кормили кукурузным маслом в объеме 10 мл/кг массы тела. После кормления мышей кормили и поили в обычном режиме, а фекалии контрольной группы и группы, получавшей масло антарктического криля, собирали через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24 часа после кормления, соответственно, и сушили в вакууме, а затем взвешивали для определения количества фекалий в каждой группе. После взвешивания фекалии мышей из группы, получавшей масло антарктического криля, измельчали и хранили в холодильнике при температуре -80 ℃.

 

1.2.4.3 Влияние дозы при приеме внутрь на биодоступность астаксантина в масле антарктического криля

С учетом безопасности и эффективности были установлены три гаважные дозы 100, 300 и 500 мг/кг массы тела в соответствии с текущей рекомендуемой суточной дозой 3 г масла антарктического криля. В ходе эксперимента мышей случайным образом разделили на 4 группы по 6 мышей в каждой в соответствии с их массой тела. Мышей кормили кормом и водой на свободном выгуле в течение одной недели, а затем голодали без корма и воды в течение 10 ч перед началом эксперимента и обрабатывали маслом антарктического криля в дозах 0 мг/кг-кг-бв (контрольная группа), 100 мг/кг-кг-бв (группа низких доз), 300 мг/кг-кг-бв (группа средних доз), 500 мг/кг-кг-бв (группа высоких доз) и 10 мл/кг-кг-бв (группа высоких доз), соответственно.     Объем гаважа 10 мл/кг-животного был приготовлен по методу 1.2.4.1, что соответствует 0, 0,026, 0,078 и 0,13 мг/кг-животного эквивалента астаксантина, соответственно, и после гаважа мышей кормили и поили в обычном режиме. Фекалии собирали в течение 24 часов, высушивали в вакууме, взвешивали, измельчали и хранили в холодильнике при температуре -80 ℃, а общее содержание астаксантина определяли методом ВЭЖХ.

 

1.2.4.4 Обнаружение и биоусвояемость общего астаксантина в фекалиях мышей

Метод расчета: Измельчите и перемешайте образец фекалий, взвесьте 60 мг в пробирке объемом 15 мл, добавьте 3 мл раствора хлороформа/метанола (2:1, V/V), сонируйте в течение 5 минут, затем оставьте на 10 минут, затем центрифугируйте при 3500 об/мин в течение 30 минут, затем осторожно аспирируйте верхний слой органической фазы, повторите экстракцию 3 раза, объедините экстракты, продуйте азотом и повторно растворите экстракт в 1 мл метанола/МБТЭ (1:1, V/V), затем дважды профильтруйте с органической мембраной 0,22 мкм и продавите через мембрану 0,5 мкм. （После продувки азотом экстракт повторно растворяли в 1 мл метанола/МБТЭ (1 :1, V/V) и дважды фильтровали через органическую мембрану 0,22 мкм.  ВЭЖХ-анализ проводился в соответствии с условиями хроматографии в разделе 1.2.3, и общее количество астаксантина и относительное содержание каждой формы астаксантина рассчитывалось по стандартной кривой.

 

1.2.5 Сравнение биоусвояемости астаксантина в масле антарктического криля и масле водоросли Rhodococcus pyrenoidus    

Подопытные мыши были случайным образом разделены на 3 группы по 6 мышей в каждой в соответствии с массой тела. Мыши были адаптированы к корму и воде ad libitum в течение одной недели и голодали в течение 10 часов до начала эксперимента. Испытуемые образцы были приготовлены путем экстракции растворителем 20% (V/V) гексан-этанола из масла антарктического криля и масла водоросли Rhodococcus pyrenoidus, а раствор для гаважа был приготовлен в соответствии с методом 1.2.4.1, так что концентрация общего эквивалента астаксантина в растворе для гаважа составляла 0,06 мг/мл. Образцы давали путем гаважа в объеме 10 мл/кг массы, и по окончании гаважа давали нормальный корм и воду. Соберите фекалии мышей в течение 24 часов, высушите в вакууме, взвесьте, измельчите и храните в холодильнике при температуре -80 ℃. Определите общее содержание астаксантина методом ВЭЖХ и рассчитайте биодопустимую норму астаксантина в соответствии с методом 1.2.4.4.

 

1.3 Обработка данных

Экспериментальные данные были выражены как среднее ± SD и проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с использованием программного обеспечения SPSS 19.0 и двух-трех сравнений с использованием метода Тьюки, с P<0,05 в качестве уровня значимости.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние состава растворителя на экстракцию астаксантина из масла антарктического криля

Соединения астаксантина антарктического криля относятся к классу малополярных жирорастворимых каротиноидов, исходя из принципа экстракции растворителями и экстракции по цели, аналогичной принципу растворимости, были исследованы восемь систем растворителей для экстракции масла антарктического криля, как показано в таблице 1. Ввиду того, что в настоящее время в промышленности содержание астаксантина и фосфолипидов является важным показателем качества масла антарктического криля, при разработке данного эксперимента одновременно исследовались различные системы экстракционных растворителей на содержание астаксантина, фосфолипидов и скорость воздействия на ситуацию. Как показано в таблице 1, наибольшее содержание астаксантина было получено при экстракции масла антарктического криля 60% н-гексан-этанолом, что составило около 268,6 мг/кг. Наибольшее содержание фосфолипидов было получено при экстракции масла антарктического криля 20% (V/V) н-гексан-этанолом, что составило около 44,2%, и было значительно выше, чем в других экспериментальных группах (P<0,05).

 

По данным Lambertsen et al[17], астаксантин в масле антарктического криля находится в основном в этерифицированной форме, на долю которой приходится более 90% всего астаксантина. Поскольку молекулы этерифицированного астаксантина связаны с жирными кислотами, общая полярность молекул ниже, чем у свободного астаксантина. Поэтому, согласно принципу аналогичной растворимости и результатам таблицы 1 можно сделать вывод, что в диапазоне объемной доли н-гексана ≤ 60% (V/V), с увеличением содержания н-гексана, общая полярность растворителя уменьшается, содержание экстрагированного астаксантина в масле антарктического криля продолжает увеличиваться, и 60% н-гексан - этанол экстрагирует масло антарктического криля с самым высоким содержанием астаксантина, и 80% и 100% н-гексана по объему, экстрагированное масло антарктического криля содержит астаксантин, и 80% и 100%, экстрагированное масло антарктического криля составляет около 90% от общего содержания астаксантина. Наибольшее содержание астаксантина было получено при экстракции 60% н-гексаном-этанолом, в то время как содержание астаксантина в экстрагированном масле снижалось при 80% и 100% н-гексане по объему. В процессе эксперимента следует отметить, что при объемной доле гексана в экстракционном растворителе выше 80% (V/V) в экстракционном растворе возникает явление расслоения, что может быть связано с тем, что в сырье креветочной муки антарктического криля содержится некоторое количество воды, высокие концентрации н-гексана в системе и вода не смешиваются, растворителю трудно полностью проникнуть в сырье креветочной муки, в результате чего соединения астаксантина не могут быть эффективно выщелочены. Результаты показали, что 95% креветочного порошка было экстрагировано н-гексаном, который является наиболее эффективным способом извлечения астаксантиновых соединений [18-19]. Кроме того, в табл. 1 показано, что степень извлечения 95%-ным водно-этанольным растворителем была выше, а степень извлечения н-гексановым растворителем была значительно ниже, чем в других группах (P<0,05), что может быть связано с тем, что 95%-ный водно-этанольный растворитель может извлечь некоторые высокополярные вещества в креветочной муке антарктического криля, тогда как н-гексан извлекает только низкополярные липиды [20]. Также было обнаружено, что масло криля, экстрагированное 95% этанолом и водой, было вязким, с плохой текучестью и большим количеством примесей. В итоге, результаты этой части испытаний могут служить ориентиром для направленной экстракции масла антарктического криля, промышленность может, исходя из различных потребностей в астаксантине и содержании фосфолипидов в продукте, выбрать подходящий состав растворителя для экстракции масла антарктического криля.

 

2.2 Анализ молекулярно-видового состава астаксантина в жире антарктического криля

Для дальнейшего анализа молекулярного состава астаксантина в препарате масла антарктического криля, выбор 60% (V/V) н-гексан-этанольной экстракции масла антарктического криля в качестве образца, ВЭЖХ-МС анализ и обнаружение и нормализация площади пика, состав молекул астаксантина и относительное содержание астаксантина, как показано в таблице 2, использование 60% (V/V) н-гексан-этанольной экстракции масла антарктического криля в астаксантине. Астаксантин в масле антарктического криля, экстрагированном с использованием 60% (V/V) гексан-этанола, существует в основном в форме моно- и диэфиров, этерифицированный астаксантин составлял около 98,38% от общего количества астаксантина, а свободная форма астаксантина составляла всего 1,62%. Среди них было идентифицировано 12 диэфиров астаксантина, общее относительное содержание которых составило 73,5%, что намного больше, чем моноэфиров астаксантина и свободного астаксантина; моноэфиров астаксантина было идентифицировано 5 видов, относительное содержание которых составило 24,88%.

Что касается молекулярного состава эфиров астаксантина, то основными жирными кислотами, связанными с астаксантином в масле антарктического криля, являются C14:0, C16:0, C16:1, C18:1, C20:0, C20:5 и C22:6, что согласуется с результатами исследований Гринбаума и др.  Grynbaum et al.[21] . Следует также отметить, что результаты предыдущего исследования Lambertsen et al.  Следует также отметить, что относительное содержание диэфиров астаксантина, моноэфиров астаксантина и свободного астаксантина в антарктическом криле по данным Lambertsen et al.[17] составляло 51%, 43% и 6%, соответственно, а относительная доля астаксантина в этерифицированной форме составляла около 94%. Относительное содержание астаксантина в этерифицированной форме составило 98,3%, что несколько выше, чем по данным Lambertsen et al[17]. Это объясняется тем, что молекулярная полярность этерифицированного астаксантина ниже, чем свободного. Согласно принципу сходной растворимости, с увеличением доли гексана в экстракционном растворителе общая полярность растворителя уменьшается, и сродство к этерифицированному астаксантину постепенно увеличивается, а сродство к свободному астаксантину постепенно уменьшается, и когда объемная доля н-гексан-этанола в экстракционной системе достигает 60%, обнаруживается больше этерифицированного астаксантина по сравнению со свободным астаксантином. Когда объемная доля н-гексан-этанола в экстракционной системе достигла 60 %, было извлечено больше этерифицированного астаксантина по сравнению со свободным, что согласуется с исследованиями Foss et al[22] и Yamaguchi et al[23].

 

2.3 Переваривание и всасывание астаксантина из масла антарктического криля у мышей

2.3.1 Изменение молекулярного состава астаксантина в фекалиях мышей с течением времени   

Чтобы изучить процесс переваривания и всасывания астаксантина в масле антарктического криля у мышей, в этой части исследовали изменения относительного содержания свободного астаксантина, моноэфира астаксантина и диэфира астаксантина в фекалиях мышей в разные моменты времени после дачи масла антарктического криля, и результаты представлены на рисунке 1.

На рисунке 1 показано, что астаксантин, содержащийся в жире антарктического криля, начинает метаболизироваться в организме мышей через 2-4 часа после приема. Диэфир астаксантина достиг максимального значения 64,54% в 4 ч, затем его относительное содержание быстро снизилось до менее 2% в 14 ч и только 0,61% в 24 ч. Моноэфир астаксантина начал расти с 2 ч и достиг максимального значения в 8 ч, затем немного снизился, но затем восстановился и оставался относительно стабильным в 14 ч. Относительное содержание свободного астаксантина начало постепенно расти с 2 ч и достигло максимального значения в 12 ч, затем немного снизилось и оставалось относительно стабильным. Содержание свободного астаксантина постепенно увеличивалось с 2 ч до 12 ч, затем достигло максимального значения, после чего немного снизилось и оставалось относительно стабильным. Начиная с 14 ч, астаксантин в фекалиях мышей содержался в основном в свободной форме и в виде моноэфира астаксантина, причем относительное содержание не сильно отличалось. Между группой, получавшей масло антарктического криля, и контрольной группой не было обнаружено существенной разницы в изменении количества фекалий с течением времени (рис. 2), что свидетельствует о том, что дача масла антарктического криля не оказала существенного влияния на количество фекалий подопытных мышей.

Согласно результатам предыдущих экспериментов, астаксантин в масле антарктического криля содержится в основном в форме диэфира, затем моноэфира, а содержание свободного астаксантина очень низкое. Поэтому можно предположить, что диэфиры астаксантина разлагаются и преобразуются в моноэфиры астаксантина и свободный астаксантин в организме мышей, а затем поглощаются и утилизируются. Этот результат согласуется с пищеварительными и поглотительными свойствами эфиров астаксантина из красного Coccidioides aurantium, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях [24-25].

 

2.3.2 Биоусвояемость астаксантина в масле антарктического криля   

Биодоступность астаксантина в масле антарктического криля в различных дозах при гаваже оценивалась с использованием концепции биодоступной скорости, предложенной Failla et al[16] . На рисунке 3 показана биодоступность астаксантина в масле антарктического криля после приема с пищей различных доз масла антарктического криля в соответствии с формулой. Результаты показывают, что биодоступность астаксантина в масле антарктического криля существенно не отличается между группами с низкой, средней и высокой дозой, составляя примерно 74 %. Это может быть связано с текущим рекомендуемым ежедневным потреблением масла антарктического криля в испытании были разработаны в соответствии с тремя группами дозы гаважа 100, 300 и 500 мг / кг веса тела, и масло антарктического криля общее содержание астаксантина около 260 мг / кг креветочного масла, поэтому три группы дозы, соответствующие эквивалентной дозе астаксантина гаважа 0,026, 0,078, 0,13 мг / кг веса тела, относительно низкая доза. Таким образом, соответствующие эквивалентные дозы астаксантина при приеме внутрь в трех группах доз составляли всего около 0,026, 0,078 и 0,13 мг/кг массы тела, что является относительно низкой дозой.

 

2.4 Сравнение биоусвояемости астаксантина в масле антарктического криля и масле водоросли Rhodococcus pyrenoidus

Рекомендуемая суточная доза астаксантина для взрослых составляет 4 мг, что в пересчете на мышей составляет 0,6 мг/кг массы тела при приеме внутрь в исследовании Capelli et al.26 Биоусвояемость астаксантина в различных экспериментальных группах показана на рисунке 4. На рисунке 4 показано сравнение биоусвояемости астаксантина из масла антарктического криля и красных водорослей при приеме с пищей в разных экспериментальных группах. Результаты показали, что биоусвояемость астаксантина из масла антарктического криля была значительно выше, чем у астаксантина из красных водорослей, что примерно в 1,25 раза превышало биоусвояемость астаксантина из красных водорослей. Сообщалось [27-29], что на биодоступность каротиноидов влияют их структура, характеристики растворимости и матричные эффекты. Поэтому мы предполагаем, что это может быть связано с присутствием в масле антарктического криля амфифильных веществ, таких как фосфолипиды [30], которые способствуют гидролизу этерифицированного астаксантина в масле антарктического криля до свободного астаксантина и облегчают его вхождение в смешанные мицеллы, что приводит к лучшему всасыванию астаксантина в желудочно-кишечном тракте.

 

3 Заключение

В данной работе было проведено систематическое исследование влияния различных концентраций н-гексан-этаноловых растворителей на экстракцию масла антарктического криля, а также изучено переваривание и всасывание астаксантина в масле антарктического криля в экспериментах на животных in vivo. Результаты показали, что 60% (V/V) н-гексан-этанол является наиболее эффективным растворителем для экстракции астаксантина, и в масле антарктического криля было обнаружено 17 этерифицированных астаксантинов, среди которых 12 диэфиров астаксантина составляли 73,5% относительного содержания, 5 моноэфиров астаксантина составляли 24,88% относительного содержания, а относительное содержание свободной формы астаксантина составляло около 1,62%; диэфиры астаксантина разлагались на моноэфир астаксантина и свободную форму астаксантина в организме мышей. У мышей диэфиры астаксантина разлагались на моноэфиры астаксантина и свободный астаксантин; после 24 ч кормления разница в биоусвояемости астаксантина между группами с низкой, средней и высокой дозой была незначительной, а биоусвояемость составила около 74%; биоусвояемость астаксантина, полученного из масла антарктического криля, была значительно выше, чем у астаксантина, полученного из Rhodococcus pyrenophorus, и примерно в 1,25 раза выше, чем биоусвояемость астаксантина, полученного из Rhodococcus pyrenophorus. Данное исследование закладывает основу для дальнейшего изучения механизма усвоения, метаболизма и транспорта астаксантина в масле антарктического криля в живых организмах, создает научную базу для направленной промышленной добычи и применения масла антарктического криля, а также оценки пищевых свойств.

 

Ссылки:

[1 ] Zhou Li, Zhang Minghao, Yao Jiaxu, et al. Прогресс метода экстракции и физиологической активности масла антарктического криля [J/OL]. Food Industry Science and Technology:1-13 [2021-05-17]. https://doi.org/ 10.13386/j.issn1002-0306.2020060250.

[2] TANG Yixin, LIU Xiaofang, LIU Jianzhi, et al. Влияние потребления масла антарктического криля на липидный обмен у крыс, получавших нормальную диету[J]. Журнал университета Циндао (медицинское издание), 2020, 56(1): 62-66.

[3 ] Bonaterra A G, Driscoll D, Schwarzbach H, et al. Krill oil-in- water emulsion protects against lipopolysaccharide-induced proin- flammatory активации макрофагов in vitro[J]. Marine Drugs, 2017, 15(3):74-85.

[4 ] Tome-Carneiro J, Crespo-Carmen M, Burgos-Ramos E, et al. Пахта и фосфолипиды масла криля улучшают резистентность гиппокампа к инсулину и синаптической сигнализации у пожилых крыс [J].   Molecular Neurobiology, 2018, 55(9):7285-7296.

[5 ] Xie D, Gong M Y, Wei W, et al. Масло антарктического криля (Euphausia superba): всесторонний обзор химического состава, технологий извлечения, пользы для здоровья и современного применения[J]. , пользы для здоровья и современного применения[J].   Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2019, 18(2):514-534.

[6 ] SajadF, Fatemeh A, Leila D, et al. Astaxanthin: a mechanistic review on its biological activities and health benefits[J]. Pharmacological Research, 2018, 136(10):1-20.

[7 ] Sun W, Shi B, Xue C, et al. Сравнение крилевого масла, экстрагированного этанол-гексановым методом и субкритическим методом[J]. Food Science & Nutrition, 2019, 7(2):700-710.

[8 ] Sun D, Cao C, Li B, et al. Исследование комбинированной сушки тепловым насосом с сублимационной сушкой антарктического криля и его влияния на липиды[J].   Journal of Food Process Engineering, 2017, 40(6): 12577-12584.

[9 ] Xie D, Jin J, Sun J, et al. Сравнение растворителей для экстракции масла криля из шрота криля: выход липидов, содержание фосфолипидов, состав жирных кислот и минорных компонентов[J]. Состав жирных кислот и минорные компоненты[J].  Пищевая химия, 2017, 233:434-441.

[10 ] Xu Xiaobin, Fan Ningning, Zong Jun. Исследовательский прогресс процесса экстракции масла антарктического криля [J]. Наука и технология пищевой промышленности, 2018, 39 ( 18 ): 306-310.

[11 ] Mandalari G, Bisignano C, Filocamo A, et al. Bioaccessi- bility of pistachio polyphenols, xanthophylls, and tocopherols during simulated human пищеварения человека[J]. Nutrition, 2013, 29(1):339-344.

[12 ] Failla M L, Chitchumronchokchai C, Ferruzzi M G, et al. Ненасыщенные жирные кислоты способствуют биодоступности и базолатеральной секреции каротиноидов и α-токоферола клетками Caco-2[J]. Food & Function, 2014, 5(6):1101-1112.

[13] Чарльз Ф. П., Мэтью М. Н., Бен Д. М. и др. Межгодовое и межвидовое сравнение липидов, жирных кислот и стеринов антарктического криля из района исследования US AMLR Elephant Island [J]. В районе исследования острова Элефант AMLR [J].

Сравнительная биохимия и физиология Часть B: Биохимия и молекулярная биология, 2002, 131(4): 733-747.

[14] Zhou Q, Xu J, Yang S, et al. Влияние различных антиоксидантов на деградацию O/W микроэмульсий, содержащих этерифицированные астаксантины из Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Oleo Science, 2015, 64(5):515-525.

[15 ] Sun T.T.. Исследование технологии промышленного производства высококачественного масла антарктического криля [D]. Циндао: Океанский университет Китая, 2013.

[16] Mark, L, Failla. [PL-2] Объединенная модель пищеварения in vitro/Caco2 кишечных клеток для скрининга относительной биодоступности каротиноидов из продуктов питания и добавок[J]. 2005:14-22.

[17] Ламбертсен Г, Бреккан О Р. Метод анализа астаксана тонкого и его встречаемость в некоторых морских продуктах[J]. Журнал науки о пище и сельском хозяйстве, 2010, 22(2):99-101.

[18 ] Ronen L, Numa R, Ben-dror G. Препараты масла криля с оптимальным минеральным и металлическим составом, низким содержанием примесей и низким и

стабильные уровни tma: США, 20170354694 Al[P]. 2017-12-14.

[19] Li D M, Zhou D Y, Zhu B W, et al. Влияние потребления масла криля на уровень холестерина и глюкозы в плазме крови крыс, получавших высокохолестериновую диету[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(11):2669-2675.

[20 ] Gong M, Bassi A. Carotenoids from microalgae: a review of recent developments [J]. Biotechnology Advances, 2016, 34(8): 1396-1412.

[21 ] Grynbaum M D, Hentschel P, Putzbach K, et al. Unambi- guous detection of astaxanthin and astaxanthin fatty acid esters in krill (Euphausia superba) [J. Dana)[J]. Journal of Separation Science, 2015, 28(14):1685-1693.

[22 ] Foss P, Renstrom, Liaaen-Jensen S. Естественное появление энантиомерного и мезо-астаксантина 7*- у ракообразных, включая зоопланктон [J].  Сравнительная биохимия и физиология Часть B Сравнительная биохимия, 1987, 86(2):313-314.

[23 ] Yamaguchi K, Miki W, Toriu N, et al. Состав каротиноидных пигментов в антарктическом криле Euphausia superba[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1983, 49(9):1411-1415.

[24] ZHOU Qing-Xin, YANG Lu, XU Jie,. Исследование пищеварительных и абсорбционных свойств эфиров астаксантина, полученных из красной водоросли Rainy Seed[J]. Китайский журнал питания, 2019, 19(4): 125-132.

[25 ] Gladis N C, Trine Y, Bente R, et al. Появление в плазме неэстерифицированного астаксантина геометрических E/Z и оптических R/S изомеров у мужчин, получавших однократные дозы смесь оптических 3 и 3'R/S изомеров жирноацильных диэфиров астаксантина[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C, 2004, 139(1-3):99-110.

[26 ] Капелли Б, Чисевски Г. Натуральный астаксантин: король каротиноидов[M]. Holualoa: Cyanotech Corporation, 2007: 92-94.

[27 ] Granado-LorencioF,Blanco-NavarroI,Perez-SacristanB, et al. Биомаркеры биодоступности каротиноидов[J].    Food Research International, 2017, 99:902-916.

[28 ] Odorissi Xavier A A, Zerlotti Mercadante A. The bioaccessi- bility of carotenoids impacts the design of functional foods [J]. Current Opinion in Food Science, 2019, 26: 1-8.

[29 ] Charles D, Patrick B. Overview of carotenoid bioavailability determinants: from dietary factors to host genetic variations [J]. Trends in Food Science & Technology, 2017, 69:270-280.

[30 ] Araujo P, Zhu H, Joar F B, et al. Определение и структурное раскрытие триацилглицеринов в масле криля с помощью хроматографических методов[J]. Lipids, 2014, 49(2):163-172.