Как приготовить нанокомплексы астаксантина с бычьим сывороточным альбумином

 Астаксантин (AST), химическое название 3,3′-дигидрокси-4,4′-дикето-β,β,′-каротин, молекулярная формула C40 H52 O4, молекулярная масса 596.86, температура плавления 224 ℃, нерастворим в воде, растворим в некоторых органических растворителях, таких как дихлорид метилена, хлороформ и т.д. [1]. Молекулярная структура астаксантина представляет собой шестичленное кольцо, состоящее из двух изопентадиеновых единиц, соединенных рядом сопряженных двойных связей [2]; линейная часть молекулы имеет множество двойных связей, способна нейтрализовать свободные радикалы и сжигать реактивные виды кислорода (ROS) [3], и является самым сильным природным антиоксидантом, обнаруженным на сегодняшний день [4]. Кроме того, астаксантин обладает такими физиологическими свойствами, как противовоспалительное действие [5], ингибирование апоптоза клеток [6], защита центральной нервной системы [7] и модуляция мембранного потенциала митохондрий [8], и в настоящее время используется как пищевая добавка для человека в пищевой промышленности, а также как антиоксидант, фотопротектор и противовоспалительный ингредиент в фармацевтической и косметической промышленности [4].

 

В гидрофильных смесях органических растворителей и воды астаксантин существует в виде двух типов агрегатов: H-агрегата со структурой типа stuck-bun и синим смещением спектра, в котором преобладают сопряженные цепи и водородные связи [1], и J-агрегата, который имеет форму "голова к хвосту", красное смещение спектра и не содержит водородных связей [9]. В природе астаксантин существует в основном в свободной или этерифицированной форме, и его агрегаты можно получить, точно регулируя объемное соотношение водных и органических растворов (например, диметилсульфоксида [1], этанола [10] и ацетона [11]), причем увеличение числа водородных связей в растворе благоприятствует образованию H-агрегатов [9]. Дай и другие [12] показали, что структура π-π сопряжения и наличие межмолекулярных водородных связей в структуре Н-агрегата астаксантина приводит к более высокой эффективности переноса электронов, и, таким образом, Н-агрегаты демонстрируют более высокую эффективность поглощения, чем J-агрегаты и мономеры астаксантина в анализах in vitro по поглощению 1,1-дифенил-2-тринитрогидразина и гидроксильных радикалов; кроме того, сочетание нанокомплексов Н-агрегатов и J-агрегатов астаксантина также оказалось более эффективным, чем J-агрегаты и мономеры астаксантина в анализах по поглощению 1,1-дифенил-2-тринитрогидразина и гидроксильных радикалов. Кроме того, когда нанокомплексы H-агрегата и J-агрегата астаксантина наносили на клетки Caco-2, обработанные H2 O2, результаты показали, что H-агрегат астаксантина обладал более сильной способностью способствовать улавливанию внутриклеточных реактивных видов кислорода (ROS) и, таким образом, проявлял лучшие цитопротекторные эффекты.

 

Однако агрегаты астаксантина плохо стабилизированы и склонны к метаморфозам между собой, что затрудняет их длительное хранение в водной фазе [1,9]. В настоящее время популярно использование нанотехнологий для повышения стабильности и биодоступности астаксантина, однако систематических исследований по улучшению водной дисперсности и применению агрегатов астаксантина не проводилось, поэтому в данном исследовании мы попытались использовать белковые молекулы в качестве наноматериалов для инкапсуляции агрегатов астаксантина с целью улучшения водной дисперсности и стабильности, а также расширения его применения в пищевой и фармацевтической промышленности. Сывороточный белок - это высококачественный глобулярный белок, который составляет около 20% от общего содержания белка в коровьем молоке и содержит β-лактоглобулин (β-lg), α-лактальбумин (α-la), бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулины, лактоферрин и другие незначительные белки [13-14]. Пан и другие [15] исследовали белки сывороточного изолята и липосомы астаксантина и обнаружили, что белки сывороточного изолята могут защитить липосомы от повреждения желудочным соком, что делает астаксантин более эффективным в лечении астаксантином. Желудочный сок может защитить липосомы от повреждения желудочным соком и увеличить высвобождение астаксантина в кишечную жидкость, тем самым улучшая биодоступность и стабильность астаксантина.

 

Бычий сывороточный альбумин (БСА) с молекулярной массой 69 кДа [ 16] может инкапсулировать неполярные группы внутри молекулы за счет гидрофобных взаимодействий, формировать гидрофобное ядро после сворачивания и далее образовывать стабильную и компактную внутреннюю структуру под действием водородных связей, электростатических взаимодействий и сил Вандер-Ваальса, что придает ему гелеобразующие и эмульгирующие свойства, Он обладает свойствами гелеобразования, эмульгирования, покрытия и микрокапсулирования [13,17] и широко используется в качестве носителя для адресной доставки лекарств в пищевой и фармацевтической промышленности [18-19]. Ан и др. [20] объединили бычий гемоглобин и индоцианиновый зеленый (ICG) для формирования нанокомплексов ICG-BSA-NC путем молекулярной самосборки и показали, что их сочетание может усилить гидролиз ICG и гидролиз ICG. Было показано, что комбинация ICG-BSA-NC может улучшить стабильность гидролиза и квантовый выход фотолюминесценции (PLQY) ICG, что привело к высокой способности пассивного нацеливания, а также значительно улучшило накопление опухолей in vivo и визуализацию флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне.

 

В настоящем исследовании с использованием астаксантина и бычьего сывороточного альбумина в качестве основных материалов были получены H-агрегатные нанокомплексы астаксантин/бычий сывороточный альбумин (H-ABNs) и J-агрегатные нанокомплексы астаксантин/бычий сывороточный альбумин (J-ABNs), а механизм связывания двух агрегатов был предварительно исследован с помощью характеристик. Регулируя соотношение этанола и воды, мы исследовали влияние объемной доли этанола на образование H-агрегата астаксантина и J-агрегата астаксантина и определили оптимальные условия для образования агрегатов астаксантина. При оптимальных условиях были получены стабильные и хорошо диспергированные H-ABNs и J-ABNs. Динамическое рассеяние света, просвечивающая электронная микроскопия, ультрафиолетовая спектроскопия видимого поглощения, инфракрасная спектроскопия Фурье и флуоресцентная спектроскопия были использованы для исследования механизма связывания нанокомплексов, а также для получения данных и теоретической основы для расширения применения сывороточных белков и разработки стабильных астаксантинов и их агрегатов.

 

1 Материалы и методы

1.1 Материалы для испытаний

Астаксантин (чистота 98%): Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd; Бычий сывороточный альбумин (чистота 97%): Beijing Soleilbao Science and Technology Co., Ltd; Безводный этанол, бромистый калий, фосфотунгстовая кислота, дихлорметан, метанол и др. аналитически чистые: Sinopharm Chemical Reagent Co.

 

1.2 Инструменты и оборудование

Магнитная мешалка AMM-6T :Beijing OTXYNS Instruments Co., Ltd; Многофункциональный этикетировщик энзимов TECAN SPARK 10M :Swiss Tecan; УФ-спектрофотометр T6 :Beijing PU Analytical Instrument Co. Nano-S90 Malvern Dynamic Light Scattering Instrument, Nano-Z Malvern Dynamic Light Scattering Instrument: Malvern, UK; HT-7000 Transmission Electron Microscope: Hitachi, Japan; VERTEX70 Fourier Infrared Spectrometer: Bruker, Sweden; RF-6000 Fluorescence Spectrophotometer: Shimadzu, Japan.

1.3 Методы испытаний

 

1. 3. 1 Приготовление растворов

Этанольный раствор 0,03 мг/мл астаксантина был приготовлен по методу Чжао Иньюань и других [21] и хранился при температуре 4 ℃.

Наберите 100 мл дистиллированной воды в бутылку для образцов, добавьте 10 мг BSA и перемешивайте при 300 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы получить 0,1 мг/мл раствор BSA. Хранить при температуре 4 ℃.

 

1. 3. 2 Влияние объемной доли этанола и времени хранения на агрегаты астаксантина

Для того чтобы исследовать влияние различных значений v/v этанола и времени хранения на мономеры астаксантина или их агрегацию, методом разбавления раствора Лу и др [22] был приготовлен раствор астаксантина в этаноле/воде с 10%~100% этанола v/v. Раствор перемешивали при 25 ℃ в течение 10 мин при 200 об/мин и затем сразу же сканировали при 200~800 нм в ультрафиолетовой области с помощью энзимного маркиратора TECAN. Полноволновое сканирование проводили при длине волны 200-800 нм на ферментном маркираторе TECAN. Согласно результатам полноволнового УФ-видео сканирования, 20% этанол-этанол/водный раствор астаксантина был использован для приготовления агрегатов H-астаксантина, 35% этанол-этанол/водный раствор астаксантина был использован для приготовления агрегатов J-астаксантина, и состояние агрегатов астаксантина было зарегистрировано при комнатной температуре после 0, 2, 4, 6, 8 и 24 ч воздействия этанола, а затем подвергнуто полноволновому УФ-видео сканированию.

 

1. 3. 3 Приготовление H-ABNs и J-ABNs

Согласно результатам пункта 1.3.2 и методу, использованному Чжао Иньюанем и др [ 14], для приготовления H-ABNs использовали 20% этанол, конечная массовая концентрация AST составляла 0,003 мг/мл, а конечная массовая концентрация BSA - 0,01, 0,02 и 0,05 мг/мл. Используйте 35% спирт для приготовления J-ABNs и приготовьте раствор J-ABNs с конечной массовой концентрацией 0,003 мг/мл для AST и 0,01, 0,02, 0,05 мг/мл для BSA, соответственно, и отложите в сторону.

 

1. 3. 4 Измерение потенциала размера частиц H-ABNs и J-ABNs

В соответствии с методом, использованным Чжао и др. [10], для тестирования был взят 1 мл свежеприготовленного образца, с углом испытания 90 °, температурой испытания 25 ℃, временем равновесия 120 с и временем цикла 90. Дисперсионной средой была вода, R Ⅰ дисперсанта составлял 1,300, R Ⅰ материала составлял 1,45, и был определен размер гидратированных частиц. Дзета-потенциал определялся путем добавления 1 мл свежеприготовленного образца в потенциометрическую чашку Петри под углом 90 ° и при температуре 25 ℃ с временем равновесия 120 с и продолжительностью цикла 20 раз.

 

1. 3. 5 Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) H-ABNs и J-ABNs

Морфологию и микроструктуру H-ABNs и J-ABNs наблюдали методом ТЭМ по методике Zhu et al [23] с небольшими изменениями. Медная сетка помещалась поверх фильтровальной бумаги, 1 капля дисперсии образца помещалась на углеродную несущую мембрану медной сетки и высушивалась на воздухе естественным образом в течение 10 мин. Затем на сетку по каплям добавлялась 0,01 г/мл фосфотунгстовой кислоты. Образец высушивали при комнатной температуре и наблюдали с помощью ТЭМ при 100 кВ.

 

1. 3. 6 Расчет скорости связывания и загрузки H-ABNs и J-ABNs

Подготовка стандартной кривой: 3 мг астаксантина точно взвешивали и растворяли в 100 мл раствора дихлорметана-метанола (1:1), перемешивали при 200 об/мин в течение 1 ч при 25 ℃ для получения массовой концентрации 0,03 мг/мл раствора астаксантина-дихлорметана-метанола. Поглощение метанольного раствора астаксантина при 478 нм было измерено ультрафиолетовым спектрофотометром, и линейное уравнение метанольного раствора астаксантина-дихлорметана было получено в соответствии с законом Ламберта-Бира [24] с хорошей линейной зависимостью, y = 265. 321 43x-0. 081 57, R2 = 0. 997 72.

Расчет эффективности связывания и загрузки: свежеприготовленный раствор нанокомплекса H-ABNs собирали в томатную бутылку, незагруженный астаксантин экстрагировали добавлением 2 мл дихлорида метилена и 2 мл метанола, затем встряхивали в течение 2 мин. Органическую фазу фильтровали через органическую мембрану с размером пор 0,22 мкм, измеряли поглощение при 478 нм методом UV-vis и рассчитывали эффективность связывания (BE) [25] и эффективность загрузки (LE) [26] на основании стандартной кривой астаксантина. Эффективность связывания (BE) [25] и эффективность загрузки (LE) [26] были рассчитаны по стандартной кривой астаксантина; то же самое было сделано для J-ABNs. Формула выглядит следующим образом.

r1 = mAST/mAST total; r2 = mAST/m(BSA+AST) total где: r1 - BE ,%; r2 - LE ,%; mAST - количество астаксантина, инкапсулированного в комплекс, мг; mAST total - общее количество астаксантина в тесте, мг; m(BSA+AST) total - общее количество BSA и астаксантина, мг.

 

1. 3. 7 Измерение спектров поглощения в ультрафиолетовом диапазоне (UV-vis) H-ABNs и J-ABNs

Полноволновое сканирование H/J-ABNs проводилось с помощью энзимного маркиратора TECAN. 200 мкл свежеприготовленных H-ABNs и J-ABNs сканировались при 200~800 нм в УФ-области для наблюдения спектроскопических эффектов различных образцов.

 

1. 3. 8 Спектральное сканирование флуоресценции H-ABNs и J-ABNs

Спектры флуоресценции H-ABNs и J-ABNs измеряли на флуоресцентном спектрофотометре RF-6000 с длиной волны эмиссии 280 нм, диапазоном сканирования 280~400 нм, скоростью сканирования 6000 нм/мин и шириной щели возбуждения и эмиссии 10 нм, по методу Линг Хуанга [27] с некоторыми изменениями.

 

1. 3. 9 Измерения H-ABNs и J-ABNs с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR)

Растворы H-ABNs и J-ABNs добавляли по каплям на предметное стекло KBr, высушивали и исследовали в условиях сканирования 25 ℃, разрешения 4 см-1, диапазона сканирования 400-4000 см-1 и 16 раз сканирования; тот же метод применялся к порошкообразным смесям BSA, AST и BSA-AST. ИК-спектры были проанализированы с помощью программы OMNIC 8.2.

 

1.4 Обработка данных

Каждую группу тестов повторяли три раза, а результаты представляли как среднее ± стандартное отклонение. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью программ Microsoft Excel 2019, OM-NIC 8.2, Origin 8.0 и IBM SPSS 22.0.

 

2 Результаты и анализ

2.1 Влияние объемной фракции этанола и времени хранения на морфологию астаксантина

Астаксантин может образовывать агрегаты при различных соотношениях органических и водных смесей, причем увеличение количества водородных связей в системе способствует образованию желтоватых H-агрегатов [28]; когда органическая фаза является основной дисперсионной средой, содержание водородных связей в системе уменьшается, и астаксантин, как правило, существует в растворе в виде мономера M оранжевого цвета [11]. При добавлении 0,03 мг/мл астаксантина к различным соотношениям этанола и дистиллированной воды свойства астаксантина в растворе изменялись, как показано на рис. 1(а). При объемной доле этанола 10-20 % раствор приобретал желтоватый цвет, что объясняется большой долей водной фазы в системе и большим количеством водородных связей, которые приводят к образованию астаксантина с желтоватым цветом в виде карточной упаковки, Максимальный пик поглощения находился около 387 нм (рис. 1(b)); раствор становился розово-фиолетовым, когда объемная доля этанола составляла 25%~50%, и предполагалось, что с увеличением доли органической фазы количество водородных связей уменьшалось, что приводило к образованию розово-фиолетовых, спектрально красноватых J-агрегатов "голова к хвосту", а УФ-пики смещались вправо и становились пиками "плечо к плечу", соответственно, при 510~510 нм (рис. 1(c)). УФ-пики поглощения постепенно смещались вправо, образуя боковые пики между 510~530 нм и 550~580 нм, соответственно (рис. 1(c)). При объемной доле этанола более 60% цвет раствора постепенно становился темно-оранжевым, доля водной фазы значительно уменьшалась, и молекул воды не хватало для участия в образовании агрегатов астаксантина, что приводило к постепенному увеличению образования М-мономеров, а пики поглощения представляли собой один пик при 480 нм (рис. 1(d)). Оптические свойства агрегатов астаксантина, образовавшихся при различных объемных долях этанола в данном эксперименте, согласуются с результатами Лу и др [22].

 

На основании УФ-визуальных спектров астаксантина в различных объемных долях органической фазы были приготовлены H-AST с 20% органической фазы и J-AST с 35% органической фазы, образцы хранились при 25 ℃, и цвет и ультрафиолетовое поглощение образцов изменялись в различные промежутки времени, как показано на рис. 2. Раствор H-AST был светло-желтым в 0 ч, и постепенно изменился на фиолетово-красный через 6 ч. Ультрафиолетовый спектр показал значительное снижение характерных пиков поглощения H-AST через 6 ч, максимальные пики поглощения постепенно смещаются от 388 нм к пикам при 520 нм и 560 нм, а максимальные пики поглощения постепенно смещаются от 520 нм к 560 нм. Спектр показал, что характерный пик поглощения H-агрегата астаксантина начал резко уменьшаться через 6 ч, а максимальный пик поглощения постепенно смещался от 388 нм к плечу пика поглощения с пиками около 520 нм и 560 нм, что указывает на нестабильность одного H-агрегата и постепенный переход к J-агрегату в процессе хранения. J-агрегат был фиолетово-красным в начале, и его цвет не изменился значительно в течение 24 ч хранения, что указывает на стабильность J-агрегата астаксантина. Стабильность астаксантина в J-агрегатах была выше, чем стабильность астаксантина в H-агрегатах.

 

2.2 Получение и анализ потенциала размера частиц H-ABNs и J-ABNs

H-ABNs и J-ABNs (конечная массовая концентрация AST 0,003 мг/мл) были приготовлены с использованием раствора BSA с массовыми концентрациями 0,01, 0,02 и 0,05 мг/мл в качестве носителя, результаты представлены на рис. 3. H-ABNs были бледно-желтыми, а J-ABNs - розово-фиолетовыми. Оба они были чистыми и прозрачными, с однородным цветом, без флокуляции и без осадка. Явления Тиндалла у обоих были равномерными, а оптические пути - однородными, что говорит о хорошей дисперсии обоих.

Потенциалы размера частиц образцов H-ABNs и J-ABNs представлены в таблице 1. С увеличением массовой концентрации BSA PDI обоих образцов постепенно уменьшался, что свидетельствует о постепенном повышении степени дисперсности и стабильности наносомной системы. Размер частиц H-ABNs был наименьшим при концентрации BSA 0,05 мг/мл, который составлял ( 146 ± 24) нм, а PDI - 0,43. Между тем, размер частиц J-ABNs также был наилучшим, который составлял ( 266 ± 8) нм, а PDI - 0,19, что указывает на монодисперсность раствора, однородный размер частиц и хорошую степень дисперсии (PDI<0,3). Потенциалы H-ABNs и J-ABNs составили (-9,69 ± 0,89) мВ и (-6,16 ± 0,45) мВ, соответственно, при 0,05 мг/мл BSA. По сравнению с одиночными агрегатами, наносистемы позволили агрегатам астаксантина существовать более стабильно.

 

2.3 ТЭМ-анализ H-ABNs и J-ABNs

H-ABNs и J-ABNs были приготовлены с использованием AST в конечной массовой концентрации 0,003 мг/мл и BSA в конечной массовой концентрации 0,05 мг/мл, и их картины просвечивающей электронной микроскопии показаны на рисунке 4. H-ABNs были почти сферическими, с компактными частицами, периферийные молекулы белка были расположены более плотно, чем у J-ABNs, и небольшое количество серого флоккулента присутствовало на периферии частиц, что предположительно является воздействием гидрофобных участков белков; частицы были однородными по размеру, неадгезивными и хорошо диспергированными, а их средний размер частиц TEM был близок к размеру гидратированных частиц DLS и оба были менее 200 нм; J-ABNs были сферическими по форме, и сфера состояла из черного твердого участка и свободного периферийного кольца белка, которое было таким же, как и у J-ABNs. J-ABN были сферическими, состоящими из черной твердой области и периферии из рыхлого белка, однородными по размеру, неадгезивными и хорошо диспергированными, со средним размером гидратированных частиц DLS 200~300 нм и средним размером частиц TEM около 200 нм. Размер частиц TEM был немного меньше размера частиц динамического рассеяния света (DLS) из-за того, что нанокомплексы в гидратированных частицах находились в состоянии раствора и молекулярное состояние было относительно рыхлым. Размер и морфология частиц H-ABNs и J-ABNs соответствовали результатам исследования Zhao Yingyuan et al [14]. Можно предположить, что астаксантин успешно инкапсулируется в гидрофобное ядро, образованное бычьим сывороточным альбумином.

 

2.4 UV-vis анализ H-ABNs и J-ABNs

UV-vis H-ABNs и J-ABNs с концентрацией BSA 0,01, 0,02, 0,05 мг/мл показаны на рисунке 5. Максимальный пик поглощения H-ABNs находился в районе 388 нм, а в диапазоне 460~500 нм наблюдалось слабое плечо пика. Поглощение H-ABNs увеличивалось, а затем уменьшалось с увеличением содержания BSA, в то время как поглощение плечевого пика уменьшалось, а затем увеличивалось, поэтому было предположено, что агрегаты H, инкапсулированные в H-ABNs, постепенно трансформировались с увеличением массовой концентрации BSA. J-ABNs имели два пика поглощения при 530 нм и 580 нм, и поглощение пика J-ABNs постепенно увеличивалось с увеличением содержания BSA, как показано на рис. 5, что говорит о том, что увеличение массовой концентрации BSA в определенном диапазоне благоприятствует образованию J-ABNs. По сравнению с нанокомплексами астаксантина, приготовленными Zhao et al [ 10], УФ-спектры поглощения H-ABNs были в основном схожи; максимальные пики поглощения J-ABNs были в основном такими же, как у J-ABNs, но наблюдалась разница в размере плеч пиков, что предположительно является изменением специфического связывания астаксантина с BSA при увеличении массовой концентрации BSA.

 

2. 5 Анализ связывания и нагрузки H-ABNs и J-ABNs

Скорость связывания и загрузки BSA при массовой концентрации 0,05 мг/мл для H-агрегатного астаксантина составила 61,10% и 3,46%, соответственно; для J-агрегатного астаксантина скорость связывания и загрузки составила 66,47% и 9,72%, соответственно. По сравнению с бинарными нанокомплексами астаксантин-казеин в предыдущем исследовании [21], скорость связывания и загрузки казеина с H-агрегатом астаксантина составила 44,8% и 10,3%, соответственно, а с J-агрегатом астаксантина - 22,7% и 4,54%, соответственно, что указывает на то, что бычий сывороточный альбумин, использованный в настоящем исследовании, обладает лучшим связывающим действием на астаксантин и улучшает скорость загрузки J-агрегата астаксантина. Скорость загрузки астаксантина в J-агрегаты была улучшена.

 

2.6 Спектральный анализ флуоресценции H-ABNs и J-ABNs

Yao Huifang et al.[29] обнаружили, что жирорастворимые активные молекулы соединяются с БСА посредством водородной связи, электростатического взаимодействия, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобного взаимодействия, а затем изменяют внутреннюю структуру БСА в процессе формирования нового комплекса, вызывая тем самым вспышку флуоресценции, и в то же время было доказано, что антоцианы могут связываться с остатками триптофана на поверхности молекулы БСА для изменения ее пространственного положения, формирования нового комплекса и вызывания статической вспышки. Спектры флуоресценции H-ABNs и J-ABNs показаны на рисунке 6, мономер AST не имеет флуоресценции, а BSA имеет максимальную длину волны эмиссии при 342 нм, что является широкополосной флуоресценцией, и может быть идентифицировано как остаток триптофана [30]. Как показано на рисунке 6, интенсивность флуоресценции H-ABNs и J-ABNs резко снизилась из-за всплеска флуоресценции BSA, а максимальные длины волн эмиссии H-ABNs и J-ABNs были смещены на 10 нм относительно BSA. Предполагается, что сочетание агрегированного астаксантина с BSA привело к увеличению гидрофобности в микромире остатка аммиака, что позволяет предположить, что гидрофобность микромира вокруг липидорастворимых малых молекул была увеличена сочетанием агрегированного астаксантина и BSA. Гидрофобная микроячеистая область, созданная БСА, была успешно инкапсулирована с липидорастворимой активной малой молекулой астаксантина.

 

2.7 ИК-Фурье анализ H-ABNs и J-ABNs

Характерные пики поглощения молекул БСА при 1 600-1 700 см- 1 - это в основном пики растяжения -OH БСА при 1 500-1 600 см- 1, которые в основном вызваны растягивающими колебаниями связи C-N и изгибными колебаниями связи N-H [32], и пики растяжения -OH БСА при 3 500-3 400 см- 1 [33]. -БСА, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ, АСТ и АСТ. Инфракрасные спектры физических смесей порошков BSA, AST, AST-BSA, растворов H-ABNs и J-ABNs представлены на рисунке 7. Как показано на рис. 7, полосы амида Ⅰ, амида Ⅱ и пики растяжения -OH H/J-ABNs были значительно ослаблены, что указывает на взаимодействие АСТ с БСА и изменение внутренней структуры БСА; многочисленные пики молекулы АСТ в диапазоне 900~1 700 см-1 почти исчезли, что говорит о том, что АСТ был успешно завернут во внутреннее ядро БСА. Инфракрасные пики физической смеси AST-BSA объединяли пики AST и BSA, которые не взаимодействовали друг с другом, и их пики оставались неизменными.

 

3 Заключение

В данном исследовании методом молекулярной самосборки были получены комплексы астаксантина и бычьего сывороточного альбумина, а также H-агрегированные нанокомплексы астаксантин/бычий сывороточный альбумин (H-ABNs) и J-агрегированные нанокомплексы астаксантин/бычий сывороточный альбумин (J-ABNs). Цвет раствора астаксантина изменялся после растворения в различных объемных долях этанола. 10%~20% этанола демонстрировали H-агрегацию астаксантина, и раствор был светло-желтым; 25%~50% этанола формировали J-агрегацию астаксантина, и раствор был фиолетово-красным; свыше 60% этанола демонстрировали оранжевый цвет, который предположительно являлся M-мономером астаксантина. Оптимальными условиями для получения H-ABNs были 20% v/v этанольный раствор астаксантина и 35% v/v этанольный раствор астаксантина для J-ABNs. Динамический анализ размера частиц светорассеяния (DLS) показал, что размеры гидратированных частиц H-ABNs и J-ABNs были на самом маленьком наноразмере при концентрации BSA 0,05 мг/мл, а степень дисперсии J-ABNs была лучше, с высокой степенью дисперсии для J-ABNs, и высокой степенью дисперсии для H-ABNs и J-ABNs. Дисперсия J-ABNs была лучше, и стабильность астаксантина была улучшена по сравнению с одиночными агрегатами. В сочетании с изменением характерных пиков инфракрасного спектра, снижением интенсивности флуоресценции и синим смещением максимума спектра излучения из-за флуоресцентного тушения БСА в спектре флуоресценции, можно предположить, что гидрофобность микроокружения аминокислотных остатков БСА была увеличена комбинацией астаксантина и БСА за счет водородной связи, электростатического взаимодействия, Ван-дер-Ваальсовых сил и гидрофобного взаимодействия, что подтверждает успешную инкапсуляцию астаксантина в гидрофобный микромир, созданный БСА. В этом исследовании был успешно получен метод приготовления H/J-ABNs и предварительно исследован механизм связывания комплексов H/J-ABNs с помощью различных характеристик, что обеспечило теоретическую основу для улучшения стабильности и биодоступности агрегатов астаксантина, и ожидается, что это расширит применение астаксантина и его агрегатов в области продуктов питания и медицины.

 

Ссылки.

 

[ 1] BROTOSUDARMO T H P , LIMANTARA L , SETIYONO E , et al. Структуры астаксантина и их последствия для терапевтического применения [J] . Международный журнал науки о пище, 2020, 2020: 2156582.

[2] STACHOWIAK B , SZULC P. Астаксантин для пищевой промышленности [J] . Molecules , 2021 , 26(9) : 2666.

[3] JANNEL S , CARO Y , BERMUDES M , et al. Novel insights into the biotechnological production of Haematococcus pluvialis-derived astaxanthin: advances Новое понимание биотехнологического производства астаксантина из Haematococcus pluvialis : достижения и ключевые проблемы, которые позволят использовать его в промышленности в качестве нового пищевого ингредиента [J] . Journal of marine science and engi- neering, 2020, 8( 10) : 789.

[4] NISHIDA Y , NAWAZ A , HECHT K , et al. Astaxanthin as a novel mitochondrial regula- tor : a new aspect of carotenoids, beyond an- tioxidants [ J ] .  Nutrients, 2021, 14 ( 1 ): 107.

[5] WU L W , MO W H , FENG J , et al. Астаксантин ослабляет повреждение печени и мито-хондриальную дисфункцию при неалкогольной жировой болезни печени путем повышения- регулируя путь FGF21/ PGC-1 α [ J ] .  Британский журнал фармакологии, 2020, 177 (16): 3760 - 3777.

[6] CHUNG B Y , PARK S H , YUN S Y , et al. Astaxanthin protects ultraviolet B-induced ox- idative stress and apoptosis in human kerati- nocytes via intrinsic апоптотический путь [J]. Анналы дерматологии, 2022, 34 (2): 125- 131.

[7] RAHMAN S O , PANDA B P , PARVEZ S , et al. Нейропротекторная роль астаксантина при инсулинорезистентности гиппокампа, индуцированной пептидами Aβ, в животной модели болезни Альцгеймера [J]. болезни Альцгеймера [J]. Biomedicine & pharmacothera- py , 2019 , 110 : 47-58.

[8] SUN L Y , KIM S , MORI R , et al. Астаксантин оказывает иммуномодулирующее действие, регулируя ось SDH-HIF- 1α и перепрограммируя митохондриальный метаболизм в LPS - стимулированных клетках RAW264.7 [J] . Морские препараты, 2022, 20 (11): 660.

[9] Y.Y. Zhao , Z.X. Wang , W.J. Xue , et al. Progress of Astaxanthin Aggregates [J]. Современная пищевая наука и технология, 2021, 37(7): 327-334.

[ 10] ZHAO Y Y , LI J , DAI M Q , et al. Discrimi- native preparation stable H - or J - aggre- gates of astaxanthin in waterborne chitosan/ DNA nanoparticles [ J ] . .  Chemistry letters, 2019, 48(4) : 345-348.

[ 11] SUBRAMANIAN B , TCHOUKANOVA N , DJAOUED Y , et al. Raman spectroscopic in- vestigigations on intermolecular interactions in aggregates and кристаллических формах транс-астаксантина [J] . Journal of Raman spectros- copy, 2013, 44(2) : 219-226.

[ 12] DAI M Q , LI C J , YANG Z , et al. Структура агрегации астаксантина значительно влияет на его антиоксидантную активность: сравнительное исследование в клетках Caco - 2 [ J ]. J ] .  Antioxidants , 2020 , 9(2) : 126.

[ 13] Zhang Jianqiang , Diao Jingjing , Li Hao , et al. Исследование функциональных свойств сывороточного белка и его пептидных продуктов [J]. Упаковка и пищевое оборудование, 2013, 31(2): 34-36, 66.

[ 14] Zhao Yingyuan , Zhang Shengmeng , Li Yifan , et al. Исследование взаимодействия между астаксантином и сывороточным белком на основе флуоресценции и ультрафиолетовой спектроскопии [ J ]. Технологии пищевой промышленности, 2022, 43 (2): 126- 134.

[ 15] PAN L, LI H, HOU L F, et al. Gastrointes- tinal digestive fate of whey protein isolate coa- ted liposomes loading astaxanthin: lipolysis, release, and bioaccessibility [J] .  Food bio- science, 2022, 45: 101464.

[ 16] KARAMI E , BEHDANI M , KAZEMI-LOME- DASHT F. Альбуминовые наночастицы как наноносители для доставки лекарств: фокусировка на доставке антитела и нанотела и лекарств на основе альбумина [ J ]. и лекарств на основе альбумина [ J ].  Journal of drug delivery science and technology, 2020, 55: 101471.

[ 17] WAGNER J , BILIADERIS C G , MOS- CHAKIS T. Whey proteins : musings on de- naturation , aggregate formation and gelation [ J ] .  Critical reviews in food science and nutrition, 2020, 60(22) : 3793-3806.

[ 18] BABA W N , MCCLEMENTS D J , MAQ- SOOD S. Whey protein-polyphenol conju- gates and complexes : production, character- isation, and applications [J] . Food chemis- try, 2021, 365: 130455.

[ 19] BOURBON A I , PEREIRA R N , PASTRA- NA L M , et al. Protein-based structures for food applications : from macro to nanoscale [J] . Frontiers in sustainable food systems, 2018, 2 : 77.

[20] AN F F , YANG Z , ZHENG M C , et al. Ра-ционально собранный нанокомплекс альбумин/индоцианин зеленый для улучшения изображения опухоли с целью проведения фототермической терапии [ J ]. Журнал нанобиотехнологий, 2020, 18( 1) : 49.

[21] Zhao Yingyuan , Deng Yucheng , Tang Zhongyi , et al. Приготовление, характеристика и стабильность нанокомпозита астаксантин-казеин[J]. Food Science and Technology, 2021, 46( 11) : 236-243.

[22] LU L P , HU T P , XU Z G. Structural char- acterization of astaxanthin aggregates as re- vealed by analysis and simulation of optical spectra [ J ] .  Spectrochimica acta part A : molecular and biomolecular spectroscopy, 2017, 185 : 85-92.

[23] ZHU J X , SUN X W , WANG S H , et al. Формирование нанокомплексов, состоящих из сывороточных белков и фукоксантина: характеристика, спектроскопический анализ и молекулярный док - кинг [ J ]. и молекулярный док-король [ J ].  Пищевые гидроколлоиды, 2017, 63: 391-403.

[24] Hou Yahui . Разработка и внедрение быстрого детектора безопасности пищевых продуктов на основе закона Ламберта-Бира [ D ] . Пекин: Китайский университет геонаук, 2017.

[25] DU Chen , YIN Huanhuan , ZHAO Chengbin , et al. Влияние ультразвуковой обработки на структуру и функциональные свойства белково-лютеинового комплекса красной фасоли [J]. Food Science, 2020, 41( 11) : 104- 112.

[26] Wang Xiaoyi , Deng Xiaoyu , Han Lishu , et al. Влияние желудочно-кишечной среды на стабильность эмульсии Пикеринга с высокой внутренней фазой и ее загрузки астаксантином с помощью белка куколки шелкопряда [J] . Food Science, 2023, 44(6): 41-48.

[27] Huang L . Опосредованная жирными кислотами самосборка астаксантин-белка и абсорбционные свойства комплекса[D] . Фуцзянь : Университет Цзимэй, 2021.

[28] Zhao Yingyuan , Jia Huihui , Li Ziwei , et al. Прогресс агрегатов каротиноидов [J]. JOURNAL OF HENAN INDUSTRIAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION), 2021, 42(6) : 134- 140.

[29] Yao Huifang , Jing Hao . Взаимодействие между антоцианами тосканской брусники и бычьим сывороточным альбумином [J] . Food Science, 2013, 34(23) : 6- 10.

[30] ZHANG Qingqing. Исследование влияния глутаминовой аминотрансферазы на структурные и функциональные свойства сывороточного белка [ D ]. Хоххот : Технологический университет Внутренней Монголии, 2021.

[31] Shi Yan , Liu Fan , Ge Hui , et al. Инфракрасная спектроскопия изменений вторичной структуры белка при микрокапсулировании[J] . Спектроскопия и спектральный анализ, 2012, 32 (7) : 1815-1819 .

[32] JIN C G , PATEL A , PETERS J , et al. Quantum cascade laser based infrared spec- troscopy : a new paradigm for protein second- ary structure measurement [J ] . Pharmaceuti- cal research, 2023, 40(6) : 1507- 1517.

[33] Chen Sha . Приготовление натуральной композитной камеди BCC и инкапсуляция гликозидов родиолы розовой и Vc [ D ] .  Наньчанский университет , 2016.